血清miR-23b-3p、IL-18水平與肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒的病情及預后的關系

李敏，張迎輝

(1.新鄉醫學院基礎醫學院，河南 新鄉 450003；2.鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童醫院 呼吸科，河南 鄭州 450000)

肺炎支原體感染所致肺炎是兒童常見的肺部感染性疾病，約占兒童社區獲得性肺炎的10%～40%[1]。兒童由于自身組織器官、免疫系統功能發育不完全，感染肺炎支原體后進展較快，極易引起肺內外多器官功能衰竭，進而進展為重癥肺炎，此類患兒預后較差[2]。在臨床診療中，重癥肺炎病情及預后的準確評估對指導臨床治療具有重要意義?，F階段臨床常用的相關評估指標包括C反應蛋白、降鈣素原及白細胞等，但此類指標特異性較差，評估價值有限[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)近年來廣泛應用于呼吸系統疾病研究，其中miR-23b-3p是目前已知的具有抗炎作用的miRNA，其與肺炎的發生密切相關，但具體機制并不清楚[4]。白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)是一種前炎癥細胞因子，其介導的宿主免疫反應在肺炎支原體感染所致肺炎過程中發揮重要作用[5]。鑒于此，本研究分析血清miR-23b-3p、IL-18水平與肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒的病情及預后的關系，以期為患兒的早期診治提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2019年1月至2022年1月于鄭州大學附屬兒童醫院診治的163例肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒作為研究對象(重癥肺炎組)，根據患兒28 d內預后情況分為預后不良組(48例)和預后良好組(115例)，其中預后不良定義為死亡、肺部感染癥狀及并發癥控制不佳、其他系統受累控制不佳等。另選取同期收治的95例普通肺炎支原體肺炎患兒作為對照(普通肺炎組)。普通肺炎組入組標準[6]：血清學檢測肺炎支原體-IgM/IgG抗體滴度超過1∶160，血清或肺泡灌洗液肺炎支原體-DNA陽性，二者中至少一項陽性即為肺炎支原體感染。重癥肺炎組入組標準[6]：(1)胸部X線顯示超過1/3以上肺野受累或合并肺不張、胸腔積液等肺內并發癥；(2)心力衰竭、微循環障礙、水電解質紊亂、中毒性腦病等多器官功能受累。排除標準：(1)既往先天性心臟病、肝腎疾病、支氣管哮喘等疾??；(2)先天性支氣管發育不良；(3)合并吸入性肺炎、細菌性肺炎等感染性疾病；(4)意識障礙；(5)惡性腫瘤。入組患兒家屬均簽署知情同意書，本研究已經獲得醫院倫理委員會的審批同意。

1.2 研究方法

1.2.1生化指標的檢測 抽取入組兒童清晨空腹靜脈血10 mL(3份)，1份2 h內以1 500 r·min-1離心5 min(離心半徑14 cm)后提取上清，置于-70 ℃冷藏設備中備用。嚴格按照檢測試劑盒操作說明，使用雙抗體酶聯免疫吸附法檢測血清中白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)，檢測試劑盒均購于上海鈺博生物科技有限公司。使用邁瑞BC-500全自動血細胞分析儀(南京貝登醫療股份有限公司)檢測血樣中白細胞計數(white blood cell，WBC)數目及血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)。

1.2.2血清miR-23b-3p的檢測 使用miRNA提取試劑盒(天根公司，北京)提取全血樣本中miRNA，后使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)體系檢測血清中miR-23b-3p的表達，具體步驟如下：所提取miRNA經逆轉錄cDNA試劑盒(天根公司，北京)合成cDNA，以cDNA模板使用qRT-PCR擴增儀(普迪生物科技有限公司，上海)對miR-23b-3p及內參考物(U6)進行擴增(擴增液—cDNA—引物—94 ℃預變性3 min—95 ℃變性15 s—退火—60 ℃延伸40 s—40個循環)。引物序列：miR-23b-3p(上游：CACAAAGGCATCTCTACGCCCATC，下游：TGTAGCTGCC TCGCCAGAGGC)、內參考物U6(上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AACGCTTCACGAATTTGCGT)。使用2-ΔΔCt(ΔCt=樣品Ct均值-內參Ct均值)法對miR-23b-3p的表達進行定量分析。

1.2.3小兒危重病例評分(pediatric critical case score，PCIS) 此評分為肺炎患兒病情嚴重程度評分，包括胃腸系統、血壓、呼吸頻率、動脈血氧分壓、pH值、血鈉、血鉀、血尿素氮/肌酐、血紅蛋白、心率等，評分越低認為對應維度的異常情況越嚴重，總分為100分，評分越低認為病情越嚴重。

2 結果

2.1 重癥肺炎組與普通肺炎組患兒血清miR-23b-3p、IL-18水平及其他指標的變化重癥肺炎組患兒血清miR-23b-3p水平、PCIS評分低于普通肺炎組(P<0.05)，而血清IL-18、CRP、PCT、ESR、WBC水平高于普通肺炎組(P<0.05)。兩組患兒的年齡、性別、體質量差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 重癥肺炎組與普通肺炎組血清miR-23b-3p、IL-18水平及其他指標的變化

2.2 重癥肺炎組患兒血清miR-23b-3p、IL-18與相關指標的相關性重癥肺炎組患兒血清miR-23b-3p與PCT、WBC均呈負相關，而與PCIS評分呈正相關。重癥肺炎組患兒血清IL-18與CRP、PCT、WBC均呈正相關，而與PCIS評分呈負相關。見表2。

表2 重癥肺炎組患兒血清miR-23b-3p、IL-18與相關指標的相關性

2.3 重癥肺炎組患兒不同預后血清miR-23b-3p、IL-18水平的比較預后不良組患兒血清miR-23b-3p水平低于預后良好組，而IL-18水平高于預后良好組(P<0.05)。見表3。

表3 重癥肺炎組患兒不同預后血清miR-23b-3p、IL-18水平的比較

2.4 血清miR-23b-3p、IL-18對肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒預后不良的預測價值miR-23b-3p、IL-18預測肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒預后不良的AUC分別為0.791、0.779，二者聯合預測的AUC為0.857。見表4。

表4 血清miR-23b-3p、IL-18對肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒預后不良的預測價值

3 討論

肺炎支原體是兒童社區獲得性肺炎的主要病原之一，多見于5歲左右兒童，且其所致重癥肺炎逐漸增多，起病急，病情進展較快，較早出現發熱及全身感染性中毒癥狀，喘息缺氧及呼吸困難癥狀明顯，多累及肺外器官，且近年來耐藥病例逐漸增多，導致患兒預后較差[7-8]。本研究觀察到肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒預后不良發生率高達29.44%，提示患兒預后較差。肺炎支原體致病機制主要包括兩方面：一方面支原體進入呼吸道黏膜后釋放過氧化氫等有害物質破壞纖毛；另一方面激活機體體液及細胞免疫引發肺內局部大量炎癥因子、炎癥細胞釋放，引發級聯式炎癥反應[9]。本研究發現肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒CRP、PCT、ESR、WBC水平較普通肺炎升高，PCIS評分降低，可能是肺泡上皮血管內皮細胞受肺炎支原體及其毒素破壞后，粒細胞及炎癥因子迅速釋放而引發炎癥反應[10]，進而加重患兒病情。WBC、CRP等是臨床常用的評估重癥肺炎病情的指標，但其特異性及敏感性較低，常常貽誤診療時機[11]。因此，積極追尋有效評估重癥肺炎病情及預后的生物學指標仍是臨床工作之重心。

miRNA是近年來呼吸系統疾病研究的重點，是一類機體內高度保守的內源性非編碼核苷酸小分子物質，可通過與相鄰區域的非編碼miRNA調節子結合，調控目標信使RNA的表達進而調控基因的轉錄，與體內炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡等眾多生物學進程密切相關[12-13]。人類miR-23b-3p定位于第9號染色體，其分布廣泛，可通過對腫瘤壞死因子-α、IL-1β、IL-17等眾多炎癥因子的調節抑制而發揮抗炎作用[14]。戴彩同等[15]研究發現細菌感染可抑制肺泡上皮細胞中miR-23b-3p的表達，且調節其表達上調后，肺泡上皮細胞對白細胞介素-6、白細胞介素-10的釋放明顯減少，說明miR-23b-3p可下調炎癥因子的表達而發揮抗炎作用。吳英等[16]的研究發現重癥肺炎患兒外周血miR-23b-3p水平明顯降低，且相對高miR-23b-3p表達患兒外周血中腫瘤壞死因子-α、IL-6等炎癥因子表達降低，且其對患兒28 d生存情況具有較好的預測價值，提示miR-23b-3p可通過抑制炎癥因子的釋放進而改善患者預后。本研究結果證實肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒血清miR-23b-3p明顯降低，且與相關炎癥指標均呈負相關，而與PCIS評分呈正相關，說明其不僅可以反映患兒體內炎癥反應狀態，還可以反映患兒病情嚴重程度，此可為臨床治療提供方向。此外，本研究還顯示miR-23b-3p對肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒預后不良具有較高的預測價值，提示其與肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒的發生及疾病轉歸具有較好的量化關系。與既往的研究[15-16]相比，本研究進一步闡述了其與肺炎支原體感染所致重癥肺炎病情及預后具體的量化關系，筆者推測血清miR-23b-3p通過抑制腫瘤壞死因子-α、白細胞介素等炎癥因子的釋放進而發揮抗炎作用，患兒血清miR-23b-3p水平的下降可能是其發揮生物學作用而出現消耗性降低。

IL-18是機體單核巨噬細胞系統及外樹突狀細胞分泌的重要細胞因子，其結構的活化、信號的轉導過程與IL-1β類似，功能上與IL-12相似[17]。IL-18主要通過激活巨噬細胞和自然殺傷細胞產生干擾素，還可以激活多種促炎因子及細胞效應因子，促進輔助性T細胞1的增值、促進NK細胞及細胞毒T細胞表達FasL，進而引起細胞炎癥凋亡[18-19]。有研究顯示血清IL-18與支原體肺炎患兒肺部纖維化及喘息密切相關[20]。還有研究發現支原體肺炎血清IL-18與CRP呈強正相關，且與患兒病情程度密切相關[21]。這都提示IL-18可能是肺炎支原體肺炎病情進展的重要促進因素。本研究發現肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒血清IL-18升高，且其與CRP、PCT、WBC等炎癥指標呈正相關，而與PCIS評分呈負相關，提示IL-18可能促進患兒肺部炎癥反應，并加重患兒病情。既往研究也顯示IL-18與肺炎存在聯系，但具體量化關系并未報道。本研究通過ROC分析顯示血清IL-18對肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒不良預后具有較高的預測價值，進一步證實了其臨床價值，也為患兒的早期干預提供了充分的理論依據。

綜上所述，肺炎支原體感染所致重癥肺炎患兒血清miR-23b-3p水平降低，IL-18水平升高，二者與患兒病情及預后均具有較好的量化關系，二者有望成為肺炎支原體感染所致重癥肺炎診療的新靶點。此外，本研究亦有不足之處，屬于單中心研究，結果可能具有一定的偏倚，未來應設計更多的多中心研究來驗證。