輕度認知障礙患者血漿中差異表達microRNA生物信息學分析

劉艷 于明 徐宇浩

(江蘇大學附屬醫院神經內科，江蘇 鎮江 212001)

輕度認知障礙(MCI)是介于正常老化和癡呆之間的臨界狀態〔1〕。研究表明60歲以上的成年人中MCI患病率為6.7%～25.2%，其患病率的增加與年齡的增長及低教育水平高度相關，以男性更為常見〔2〕。據估計，每年有10%～ 15%的MCI患者會發展為阿爾茨海默病(AD)〔3〕。若及早發現和識別MCI階段，并對其進行積極有效的干預治療，可改善患者的認知功能，延緩MCI向AD轉化。因此，探索MCI早期診斷及預測疾病進展的生物標志物一直是研究者們關注的焦點。

microRNAs是調節神經元和神經膠質細胞功能的關鍵因子〔4〕。隨著高通量測序技術和生物信息學的發展，生物液體中的microRNA水平分析已經成為一種可行的生物標志物診斷方法。本研究應用生物信息學方法分析和篩選MCI患者血漿中關鍵的microRNAs，并對關鍵microRNA的靶基因進行富集分析。

1 材料與方法

1.1基因芯片數據來源 在NCBI(National center for biotechnology information)公共數據平臺的GEO(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數據庫搜索框中以“(mild cognitive impairment)AND microRNA”為檢索詞，選擇物種為人類(Homo sapiens)，下載GSE90828基因芯片數據集數據(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE90828)。該數據集是基于GPL22741平臺采用(Human PCR panels Ⅰ+Ⅱ，V2)miRCURY LNATMmicroRNA芯片(丹麥Exiqon公司)檢測的53例血漿標本，包含來自日本23例MCI患者和30例認知功能正常的老年人的血漿標本。MCI組樣本來源于11例男性和12例女性，平均年齡(72.78±6.80)歲；正常對照組樣本來源于12例男性和18例女性，平均年齡(70.40±4.51)歲。

1.2差異表達microRNA的篩選和數據處理 利用GEO2R在線分析工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對GSE90828數據集進行差異表達microRNA分析和篩選，利用Benjamini-Hochberg方法減少錯誤發現率。設定差異表達microRNA過濾條件為校正后的P值<0.05且|差異倍數(logFC)|≥1.0，其中logFC≥1.0為上調、logFC≤-1.0為下調。運用R(3.6.3版本)語言程序包繪制火山圖和差異表達microRNA熱圖。

1.3差異表達microRNA的靶基因預測 采用TargetScan7.2(http：//www.targetscan.org/vert_72/)在線預測工具預測差異表達microRNA的靶基因〔5〕，即通過尋找與microRNA種子序列相匹配的保守的8mer、7mer和6mer位點來預測microRNA的生物學靶點，選擇物種為人，并以Cumulative weighted context++ score<-0.4篩選靶基因，該分值越小則靶基因的置信度越高〔6〕。

1.4蛋白質-蛋白質互作網絡分析 STRING11.0(https：//string-db.org)是一個常用的蛋白質-蛋白質互作關系的數據庫，共存儲5 090個物種和2 460萬種蛋白質，擁有非常廣泛和多樣的基準數據來源〔7〕。通過對蛋白質-蛋白質相互作用的可靠性評分，以判定相互作用可靠性的大小。STRING將低可靠性、中等可靠性、高可靠性和最高可靠性的分值分別設置為0.15、0.40、0.70、0.90。本研究中構建編碼蛋白相互作用網絡(PPI)的篩選條件為中等可靠性的閾值(即Confidence score =0.4)，然后利用Cytoscape3.7.2 軟件〔8〕將蛋白質-蛋白質相互作用網絡進行可視化，通過CytoHubba插件，對網絡中所有節點進行評分，采用最大集團中心度(MCC)算法，篩選前10個關鍵基因(Hub Genes)。

1.5差異表達microRNA-靶基因相互作用網絡構建和關鍵microRNA篩選 Cytoscape3.7.2 軟件構建差異表達microRNA-靶基因相互作用網絡，使差異表達microRNA與靶基因的相互作用進行可視化，從而篩選相互作用網絡中的關鍵microRNA。差異表達microRNA靶基因的篩選閾值為cumulative weighted context++ score<-0.4。利用CytoNCA插件度量網絡中各節點的中心度(Centrality)值，選擇點度中心性(DC)參數，刪去DC值<2的節點，進而得到核心網絡，依據DC值大小進行排序，篩選核心網絡中的關鍵 microRNA。

1.6關鍵microRNA靶基因的基因本體論(GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 GO富集分析能夠對各物種基因和蛋白質的功能進行規范性描述，按照生物過程、分子功能和細胞組成對基因進行注釋和分類。KEGG是1個整合了基因組、化學、健康、系統4大類信息的綜合數據庫，通過強大的圖形功能直觀可視化地展現信號途徑及各分子間的關系。使用R語言對關鍵microRNA 的靶基因進行GO富集分析和KEGG通路分析。其中GO富集分析以q值Cutoff(校正后的P值臨界值)<0.05為篩選條件且顯示前10個GO富集分析條目；KEGG富集分析以q值Cutoff<0.05 為篩選條件且顯示前30個通路信息。

1.7統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1血漿差異表達microRNA篩選 基于MCI組與正常對照組的logFC表達和校正后的P值篩選差異表達的microRNA。與正常對照組相比，MCI組血漿中存在14個顯著下調microRNAs。顯著下調 microRNAs的具體表達情況，見表1、圖1、圖2。

表1 MCI組患者血漿中顯著下調的microRNAs

灰點表示下調的 microRNAs，黑點表示無差異的microRNAs

2.2靶基因相互作用網絡圖構建及關鍵基因的篩選 利用STRING 數據庫構建的PPI網絡圖涵蓋節點蛋白1 022個、邊3 301條，平均節點值為6.46，見圖3。利用CytoHubba插件，篩選出前10個關鍵基因，分別為泛素結合酶(UB)E2D1、轉錄延伸因(TCE)B1、視網膜母細胞瘤結合蛋白(RBBP)6、泛素蛋白連接酶E3α2(UBR2)、UBE2W、錨蛋白重復序列與SOCS盒蛋白(ASB)6、Cbl原癌基因(CBL)B、環指蛋白(RNF)7、F盒蛋白(FBX)O10和葡萄糖胺(GLMN)，它們是蛋白-蛋白相互作用網絡中的關鍵基因。

2.3差異表達microRNA-靶基因相互作用網絡的構建和關鍵microRNA的篩選 構建差異表達microRNA-靶基因相互作用網絡，見圖4。利用CytoNCA插件篩選網絡中的關鍵microRNA，DC值居于前4位的microRNAs分別為hsa-miR-27b、hsa-miR-146a、hsa-miR-23a 和has-miR-93*，是調控網絡中的關鍵microRNAs。

2.4關鍵microRNA靶基因的GO富集分析 hsa-miR-27b主要參與了神經元投射發育的調控、軸突生成、化學突觸傳遞、跨突觸信號的調節及額葉發育等生物學過程；hsa-miR-146a主要參與了信號釋放、糖蛋白代謝、高爾基囊泡轉運及囊泡定位等生物學過程；hsa-miR-23a主要參與了胚胎器官發育、泌尿生殖系統、蛋白激酶活性的激活及間充質細胞分化等生物學過程；hsa-miR-93*主要參與了神經元投射發育的調控、腺體發育、神經遞質水平的調節及糖蛋白代謝等生物學過程，見圖5。

藍色代表正常對照組樣本，紅色代表MCI組樣本

圓圈代表蛋白質，直線代表蛋白質間的相互作用；蛋白質中的螺旋表示該蛋白質的結構已知，圓圈內為空表示該蛋白質的結構未知

紅色表示 microRNA；綠色表示基因

A：hsa-miR-27b,B：hsa-miR-146a,C：hsa-miR-23a,D：hsa-miR-93*;橫坐標為基因比例，圓圈越大表示富集在該GO上的基因數目越多；縱坐標為各分子參與的生物學過程

2.5關鍵microRNA靶基因的KEGG通路分析 hsa-miR-27b的靶基因主要參與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、人鼠肉瘤(Ras)信號通路、ErbB信號通路、軸突導向、蛋白聚糖及調節干細胞多能性等信號通路，hsa-miR-146a的靶基因主要參與1型單純皰疹病毒感染、卟啉與葉綠素代謝及軸突導向等信號通路，hsa-miR-23a的靶基因主要參與糖胺聚糖的生物合成、軸突導向及轉化生長因子(TGF)-β等信號通路，hsa-miR-93*的靶基因主要參與Wnt信號通路、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑的耐藥性、Hippo信號通路及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白激酶(mTOR)等信號通路，見圖6。

A：hsa-miR-27b，B：hsa-miR-146a，C：hsa-miR-23a，D：hsa-miR-93*；橫坐標為富集在每個通路上基因的數目，顏色越紅表示基因在該通路上富集程度越高；縱坐標為各通路名稱

3 討 論

MCI作為認知障礙的早期階段，臨床表現為認知功能的輕度減退，但日常生活能力不受影響且尚未達到癡呆的診斷標準。Petersen等〔9〕將MCI分為遺忘型MCI(aMCI)和非遺忘型MCI(naMCI)兩種類型，并且指出aMCI最易向AD轉化。而AD是最常見的神經系統退行性疾病〔10〕，其發病機制主要有β-樣淀粉蛋白(Aβ)瀑布學說、Tau蛋白學說、氧化應激學說、細胞周期調節蛋白障礙學說及線粒體功能障礙等，但其具體發病機制尚未完全清楚〔11〕。然而，目前尚沒有一種藥物被批準用于治療MCI，同時針對AD發病機制不同靶點的藥物開發仍處于試驗階段。

研究已證實突觸可塑性在AD的早期發展中起著核心作用〔12〕，因此本研究推測hsa-miR-27b可能通過調節突觸傳遞過程成為MCI的潛在治療靶點。另外，單胺類神經遞質含量與認知功能密切相關〔13〕，而hsa-miR-93*與神經遞質水平的調節有關，提示hsa-miR-93*可能通過調節單胺類神經遞質的水平，參與MCI向AD的轉化過程。本研究結果顯示，這些關鍵microRNA的靶基因主要參與Ras、MAPK、ErbB、TGF-β、Wnt、Hippo和mTOR等信號通路。腎素-血管緊張素系統(RAS)是由腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉化酶、血管緊張素及相應受體構成，如抑制血管緊張素轉換酶或阻斷血管緊張素受體可以改善腦血流灌注不足，減少血腦屏障的損傷和神經認知功能的減退，從而發揮神經保護作用〔14，15〕。研究發現MAPK通路可能參與了AD中Tau蛋白的過度磷酸化及淀粉樣前體蛋白(APP)的生成過程〔16〕。自噬在神經退行性疾病中起著重要作用，其中mTOR是自噬過程的主要調節因子，受饑餓、生長因子和細胞應激源的調控〔17〕；mTOR可通過抑制自噬過程導致Aβ斑塊在腦內積累，進而促進Tau蛋白磷酸化和mTOR的激活過程〔18〕。因此，本研究篩選出的關鍵 microRNAs，可通過調節這些上述信號通路參與MCI向AD的進展過程。若抑制或增強以上信號通路中某些關鍵蛋白的表達，可能有助于改善認知功能，從而延緩MCI向AD的轉化。

綜上，MCI患者血漿中存在14個顯著下調的 microRNAs，其中有4個為關鍵microRNAs，可能成為MCI新的診斷性生物標志物。