Nrf2/HO-1和Smad通路在HIRI介導肝纖維化早期形成的作用

楊洋 宋千黛 趙婧瑤 仝琳鴿 葉圣瑩 秦燕

(大理大學基礎醫學院生理與病理生理學教研室，云南 大理 671000)

肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理過程，是肝硬化的必經階段。肝纖維化可以逆轉，而肝硬化不可逆，因此逆轉、延緩甚至阻斷肝纖維化是臨床研究的熱點〔1，2〕。肝缺血再灌注損傷(HIRI)常見于休克、肝外科手術等，其發生與氧化應激反應、細胞因子釋放、炎性細胞浸潤等密切相關，而這些因素又可以激活肝星狀細胞(HSC)，啟動肝纖維化〔3，4〕。可見HIRI與肝纖維化密切相關，利用HIRI誘導肝纖維化符合疾病的自然進程。

肝缺血后從再灌注開始到6 h內的急性損傷階段〔5，6〕，主要表現為Kuffer細胞激活，釋放活性氧簇(ROS)和炎性細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1等，共同介導肝臟的氧化應激損傷。核因子E2相關因子(Nrf)2是維持氧化還原穩態的主要細胞調節因子，是保護器官免受氧化應激損傷的胞內信號相關的重要轉錄因子〔7，8〕，在ROS刺激下Nrf2引起抗氧化反應元件調節基因的轉錄激活，調控Ⅱ相代謝酶、抗氧化酶等，發揮抗氧化作用。血紅素加氧酶(HO)-1是Nrf2下游的抗氧化酶，具有抗氧化、改善組織微循環等作用。已證明Nrf2/HO-1通路激活對HIRI具有保護作用〔9〕。轉化生長因子(TGF)-β-Smad通路是促肝纖維化形成的最重要的信號通路。本研究基于Nrf2/HO-1和Smad通路探討HIRI介導肝纖維化早期啟動的初步機制，為進一步完善肝纖維化機制提供一定依據。

1 材料與方法

1.1材料 C57雄性小鼠，體重20～25 g，SPF級，購自昆明醫科大學實驗動物中心。藥物與試劑：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、TGF-β1單克隆抗體購于Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔免疫球蛋白(Ig)G購于北京中杉生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2主要儀器 奧地利安圖2010酶標儀(奧地利安圖斯公司)；ABIStepOnePlusPCR擴增儀(美國應用生物系統公司)；T6紫外分光光度計(北京普析)；組織研磨器(北京諾博萊德科技有限公司)；免疫印跡電泳系統(美國Bio-Rad)。

1.3動物分組及模型制備 將24只C57雄性小鼠分為正常對照組(n=6)和模型組(n=18)。其中模型組根據再灌注后0 h、3 h、6 h，分為模型組0、3及6 h組。模型組用動脈夾夾閉肝門靜脈、入肝中葉和左葉的肝動脈90 min，開夾后，分別再灌注0 h、3 h和6 h。

1.4指標檢測及方法 檢測血漿中ALT、LDH和GSH-Px含量；測定肝組織SOD、MDA含量；反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測肝組織中IL-6、IL-1b、TNF-α、α-SMA、HO-1、Nrf2和TGF-β1含量；Western印跡檢測肝組織 α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad7的蛋白表達量；蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織形態學變化。

1.5統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組血漿中ALT、LDH水平變化 與對照組相比，模型組血漿ALT、LDH水平均明顯升高(P<0.05)，提示缺血再灌注后0、3、6 h，肝細胞發生嚴重損傷。見表1。

2.2各組肝組織SOD、MDA水平及血漿GSH-Px活力變化 與對照組相比，模型組肝組織SOD含量均有不同程度的降低(P<0.05)，而MDA含量則呈不同程度的升高(P<0.05)。表明模型組小鼠肝組織抗氧化能力降低，脂質過氧化水平升高。模型組血漿GSH-Px活力較對照組呈不同程度降低(P<0.05)。見表1。

2.3各組肝組織IL-6、IL-1b、TNF-α mRNA表達水平變化 RT-PCR結果顯示，模型組肝組織IL-6、IL-1b、TNF-α mRNA的表達量與對照組相比均有不同程度增加(P<0.05)，表明模型組小鼠肝組織中炎癥因子大量釋放，參與肝纖維化的發生發展。見表1。

2.4肝組織病理形態學變化 肝組織HE染色顯示，模型組肝細胞均有不同程度的水腫、顆粒變性及脂肪變性，以3 h及6 h模型組較明顯，且可見局灶性壞死、核碎裂及核溶解，并有中性粒細胞浸潤。表明缺血再灌注后，肝細胞出現不同程度的損傷，且隨時間的增加而加重。見圖1。

表1 各組血漿中ALT、LDH、GSH-Px活力及肝組織IL-6、IL-1b、TNF-α mRNA及SOD、MDA水平

圖1 各組肝組織形態學(HE染色)

2.5各組肝組織α-SMA mRNA及蛋白表達水平變化 RT-PCR、Western印跡結果顯示，與對照組相比，模型組肝組織α-SMA mRNA表達水平和α-SMA蛋白表達量均有不同程度的增加，差異有統計學意義(P<0.05)。基因表達水平與蛋白表達水平趨勢一致。提示肝組織中靜止的HSC被大量激活，啟動和促進肝纖維化的發生發展。見圖2、表2。

2.6各組肝組織TGF-β1 mRNA及蛋白表達水平變化 與對照組相比，模型3 h及6 h組肝組織TGF-β1 mRNA和蛋白的表達量均有不同程度增加，差異有統計學意義(P<0.05)。TGF-β1 mRNA水平與蛋白表達水平趨勢一致。見表2、圖3。

2.7各組肝組織Nrf2 mRNA及HO-1 mRNA表達水平變化 模型組肝組織Nrf2及HO-1 mRNA水平均較對照組下降(P<0.05)。提示缺血再灌注0、3、6 h后，由于氧化應激損傷，Nrf2/HO-1作為內源性抗氧化通路處于抑制狀態，氧化還原穩態被打破。見表2。

圖2 各組肝組織α-SMA蛋白表達水平變化

表2 各組肝組織α-SMA、TGF-β1、Nrf2、NO-1 mRNA及α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達水平

2.8各組肝組織Smad3、Smad7蛋白表達水平變化 Western印跡檢測肝組織缺血再灌注0、3、6 h后與對照組相比，模型組Smad3、Smad7蛋白表達量均有不同程度增加，模型0 h組Smad3、Smad7表達量增加明顯(P<0.05)。二者隨時間的變化趨勢基本一致。見表2、圖4。

圖3 各組肝組織TGF-β1蛋白表達水平變化

圖4 各組肝組織Smad3、Smad7蛋白表達量

3 討 論

肝纖維化是各種慢性肝臟疾病共有的一種損傷-修復病理過程，是肝硬化進程的中間環節，多種因素參與其中，包括氧化應激損傷、炎癥因子釋放等，最終活化HSC促使肝纖維化的發生和發展〔10，11〕。HSC活化是肝纖維化啟動的核心事件〔12〕。可見HIRI與肝纖維化是密切關聯的兩個病理過程。前期研究證實HIRI可以成功介導肝纖維化。TGF-β-Smad通路是致肝纖維化的經典通路之一，而Nrf2/HO-1通路是重要的內源性抗氧化通路。

本研究提示HIRI引起肝組織嚴重損傷，炎癥因子、細胞因子大量釋放，氧化應激增強，從而激活肝臟中靜止的HSC，活化HSC大量釋放細胞外基質，啟動肝纖維化，使急性損傷向慢性損傷轉化。

在HIRI介導的氧化應激中，氧自由基可以通過蛋白激酶途徑使Nrf2磷酸化，激活Nrf2/HO-1通路，進一步上調下游抗氧化酶如SOD、GSH-Px、HO-1的表達，發揮抗氧化作用，維持機體氧化還原平衡〔13〕；但如果氧自由基大量釋放則會抑制Nrf2磷酸化，關閉Nrf2/HO-1通路，使其下游抗氧化酶的表達減少，抗氧化能力減弱〔14～16〕。本研究結果提示肝缺血再灌注損傷介導肝纖維化早期階段，Nrf2/HO-1內源性抗氧化通路被抑制，機體抗氧化能力明顯降低，氧化應激增強，活化大量靜止HSC，從而啟動肝纖維化。

TGF-β1是已知的最為重要的促肝纖維化細胞因子，TGF-β/Smad通路是促肝纖維化最為重要的通路之一〔17〕。TGF-β1在信號傳導過程中主要作用的Smad蛋白包括Smad2、3、7，TGF-β1與其受體結合后可激活Smad 2和Smad3 并使其磷酸化，形成異源三聚體復合物易位入核，調控靶基因的表達〔18，19〕；Smad7可與Smad2、Smad3競爭結合TGF-β1型受體，從而阻斷Smad2、Smad3磷酸化，發揮負向調控作用，抑制或減弱TGF-β/Smad通路的作用。本研究結果說明肝纖維化啟動早期TGF-β1大量分泌后活化了Smad通路，Smad3蛋白的表達水平升高，但是同時Smad7蛋白表達水平也升高，TGF-β/Smad通路作用被削弱，因此在肝纖維啟動早期，Smad通路雖然激活了，但可能沒有起到主要的致纖維化作用。

綜上，肝細胞損傷、炎癥因子釋放、氧化應激等因素相互促進，互為因果，激活大量靜止的HSC，啟動肝纖維化的發生。其機制可能與Nrf2/HO-1內源性抗氧化通路被抑制，Smad通路被激活有關，但是Smad通路的激活在HIRI介導肝纖維化的早期啟動中可能不起主要作用。