miR-107靶向FGFRL1/AKT通路抑制胃癌耐藥細胞遷移

蔣露 張燕 任偉宏

(河南中醫藥大學 1第一臨床醫學院，河南 鄭州 450046；2第一附屬醫院檢驗科)

胃癌是全球第五大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第三大主要原因，對人類的生命健康構成了嚴重威脅〔1〕。由于缺乏有效的生物分子標志物，胃癌通常被發現時已為晚期，其5年生存率為20%～30%〔2,3〕。包括遺傳學，表觀遺傳學和環境在內的多種因素均能影響胃癌的發生發展〔4〕。現階段胃癌的臨床治療仍缺乏有效的手段，主要還是采用手術并配合化療或者化療與靶向治療聯合的方式，因此不可避免地可能會產生耐藥現象〔5〕，已有報道表明，耐藥的胃癌細胞可能更易發生轉移〔6〕。而影響胃癌轉移的因素眾多，涉及多條信號通路的調控及多種遷移相關蛋白表達的調節。因此，探究胃癌敏感和耐藥細胞遷移的強弱及其調控機制對改善胃癌的治療提供了臨床參考。微小RNA(miR)是長度為20 nt左右是非編碼小RNA，通過與靶基因mRNA特異性結合進行轉錄后負調控靶基因表達〔7〕。有研究表明，miR-107可以調控多種腫瘤的發生發展、增殖、轉移等多個生物學過程〔8～10〕。成纖維細胞生長因子受體 (FGFR)5，也被稱為FGFRL1，在調節細胞增殖、分化、黏附、融合等過程中發揮重要作用〔11〕。有報道表明，FGFRL1也能調控一些腫瘤細胞的轉移過程〔12,13〕，但其是否能調節胃癌細胞的遷移及其與miR-107之間的相互關系并不十分清楚，且miR-107是否通過靶標FGFRL1來調節胃癌細胞的遷移，并沒有相關報道。本研究以胃癌敏感和耐藥細胞為研究對象，探究miR-107和FGFRL1對其轉移的影響，并進一步闡明其調節關系。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌敏感株和5-氟尿嘧啶耐藥株細胞(SGC-7901，SGC-7901/5-Fu)購自上海慧穎生物科技有限公司；RPMI1640培養基、胰蛋白酶、青鏈霉素、RIPA組織/細胞裂解液、蛋白酶抑制劑和苯甲基磺氟(PMSF)購自索萊寶公司；opti-減/低血清培養基(MEM)購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自Biological Industries公司；TRIzol購自Life Technologies公司；mRNA逆轉錄試劑盒購自Thermo Fisher公司；SYBR green Premix Ex TaqTM熒光定量檢測試劑盒購自TaKaRa公司；miRNA 提取純化試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒及miRNA qPCR定量分析試劑盒購自康為世紀生物有限公司；Lipofectamine 2000購自invitrogen公司；24孔懸掛transwell(孔徑8 μm)購自Millipore公司；抗-FGFRL1抗體購自BBI公司；抗-GAPDH抗體和抗兔二抗購自Proteintech公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；熒光素酶活性檢測試劑盒購自Genecopoeia公司。

1.2劃痕實驗 將胃癌SGC-7901，SGC-7901/5-Fu或轉染的SGC-7901/5-Fu細胞種于12孔板，待細胞融合達95%以上，用無菌小移液器滴頭橫豎劃細胞單層，形成劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌除去劃掉的細胞碎片，用1%血清RPMI1640培養基進行培養，分別在0 h和24 h時間點進行拍照記錄，計算細胞相對遷移距離：(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.3Transwell小室實驗 將胃癌SGC-7901，SGC-7901/5-Fu或轉染的SGC-7901/5-Fu細胞種于6孔板，隨后用基礎細胞培養基饑餓培養24 h。將Transwell小室(孔徑8 μm)懸掛于24孔板，下室20% FBS的RPMI1640培養基為誘導劑，上室種200 μl胃癌細胞懸液，用無血清RPMI1640培養基培養。培養48 h后，用棉簽擦去濾膜上面未遷出的細胞，用4%多聚甲醛和0.1%結晶紫對穿過孔徑的濾膜下面的細胞進行固定和染色，倒置顯微鏡進行拍照，并計數。

1.4細胞轉染 將胃癌SGC-7901/5-Fu耐藥細胞接種到12孔或6孔板中，并分為4組：mimic NC組、miR-107 mimic組、NC組和siFGFRL1組。所用RNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，miR-107 mimic序列為：上游5′-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA-3′，下游5′-AUAGCCCUGUACAAU GCUGCUUU-3′；siFGFRL1序列為：上游5′-CGACGGCUCCUACCUCAAUAATT-3′，下游5′-UUAUUGAGGUAGGAGCCGUCGTT-3′；相對應的對照RNA由生工生物工程(上海)股份有限公司贈送。培養細胞融合度達70%左右，吸棄RPMI1640培養基，加入一定體積opti-MEM培養基，用Lipofectamine2000作為轉染試劑，用opti-MEM分別稀釋Lipofectamine2000和RNA，并將稀釋的RNA逐滴加入到稀釋的轉染試劑中，靜置10 min；將RNA-Lipofectamine2000混合物逐滴滴加到SGC-7901/5-Fu耐藥細胞中，輕輕混勻，6 h后，棄上清，加入10%FBS RPMI1640完全培養基培養。

1.5qPCR檢測FGFRL1 mRNA和miR-107水平 胃癌SGC-7901，SGC-7901/5-Fu及轉染的SGC-7901/5-Fu細胞沉淀重懸在1 ml Trizol中。然后將混合物在室溫放置5 min，加入200 μl氯仿，劇烈震蕩1 min，12 000 r/min，4℃，離心15 min。再向上清中加入500 μl異丙醇，劇烈震蕩1 min，12 000 r/min，4℃，離心10 min。用75%乙醇洗滌沉淀2次，干燥，溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。測定RNA樣品濃度，用mRNA逆轉錄試劑盒將RNA(2 μg)反轉錄為cDNA。用SYBR green Premix Ex TaqTM試劑盒檢測FGFRL1基因相對表達水平，內參基因為GAPDH。FGFRL1引物序列為：上游5′-GTGTGAGGAGCATGGGTCTC -3′和下游5′- GTGTGTGTGTGTGTGTGTGGA-3′，GAPDH引物序列為：上游5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′和下游5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′。按照miRNA 提取純化試劑盒，miRNA cDNA合成試劑盒及miRNA qPCR定量分析試劑盒的說明提取胃癌SGC-7901，SGC-7901/5-Fu細胞的miRNA，并進行miRNA的加Poly(A)尾修飾的過程，修飾后的miRNA再進行逆轉錄，最后進行定量檢測，其中miRNA cDNA合成試劑盒須與miRNA qPCR定量分析試劑盒配套使用，試劑盒提供了下游引物。miR-107上游引物序列為：5′-CGCAGCAGCATTGTACAGGGCTATCA-3′，內參基因U6上游引物序列為：5′-CCGAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′，PCR引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6Western印跡檢測相關蛋白表達 用細胞裂解液(RIPA裂解液，1% 蛋白酶抑制劑和1 mmol/L PMSF)重懸胃癌SGC-7901，SGC-7901/5-Fu細胞，加至玻璃均漿器中進行均漿破碎，將裂解液4℃，5 000 r/min離心15 min，取上清，測定蛋白濃度。將細胞裂解液在100℃下煮沸10 min變性，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，恒流將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，4℃過夜孵育抗FGFRL1抗體(1∶400)，抗p-AKT抗體(1∶500)，抗AKT抗體(1∶2 000)，抗E-鈣黏附蛋白(Cadherin)抗體(1∶1 000)，抗波形蛋白(Vimentin)抗體(1∶500)，抗基質金屬蛋白酶(MMP)9抗體(1∶1 000)和抗GAPDH抗體(1∶3 000)，洗滌后與辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育3 h，用增強型電化學發光(ECL)液進行曝光，并用ImageJ軟件進行灰度值分析。

1.7熒光素酶報告實驗 用TargetScan (http：//www.targetscan.org/vert_72/)預測出miR-107對FGFRL1的靶標結合位點有2處，并用高斯熒光素酶(Gluc)報告載體(pEZX-MT05)構建了FGFRL1野生型表達載體(插入序列為：5′-cTGGACACACAGATAATGCTGCc-3′和5′-aCACACACACAGATAATGCTGCc-3′)和突變型表達載體(插入序列為：5′-cTGGACACACAGATTACGACGc-3′和5′-aCACACACACAGATTTACGACGc -3′)，該熒光素酶報告載體的內參報告基因為分泌型堿性磷酸酶(SeAP)，載體構建由Genecopoeia公司完成。

隨后在HEK 293T工具細胞中驗證了miR-107與FGFRL1的靶標關系，將293T細胞種于24孔板，用Lipofectamine2000將上述構建的野生型或突變型熒光素酶報告載體與miR-107 mimics或miR-107 mimics NC進行共轉染，48 h后收集細胞上清，用熒光素酶活性試劑盒對Gluc和SeAP的活性進行定量測定，并計算出高斯熒光素酶的相對活性。

1.8統計學分析 采用SPASS19.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和Dunnett-t檢驗。

2 結 果

2.1胃癌SGC-7901/5-Fu耐藥株細胞遷移能力更強 用wound-healing劃痕和transwell小室實驗測定了5-FU敏感和耐藥SGC-7901細胞遷移能力。結果表明，與敏感株SGC-7901相比，SGC-7901/5-Fu耐藥株細胞劃痕愈合相對遷移距離明顯更大，穿過小室的細胞數量明顯更多，耐藥株細胞的遷移能力顯著強于SGC-7901敏感株細胞(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 0和24 h劃痕及transwell小室實驗測定SGC-7901和SGC-7901/5-Fu細胞遷移(結晶紫染色，×200)

表1 SGC-7901敏感和耐藥細胞遷移水平、miR-107、FGFRL1 miRNA和蛋白表達比較

2.2胃癌SGC-7901敏感和耐藥株細胞中miR-107和FGFRL1表達水平 與敏感株細胞SGC-7901相比，SGC-7901/5-Fu耐藥株細胞中miR-107顯著低表達，而FGFRL1 mRNA及蛋白顯著高表達(P<0.05)。推測miR-107可能通過調控FGFRL1的表達調節胃癌SGC-7901敏感和耐藥株細胞的遷移。見表1、圖2。

圖2 FGFRL1在SGC-7901和SGC-7901/5-Fu細胞中的表達水平

2.3熒光素酶報告實驗鑒定FGFRL1是miR-107的靶標分子 根據Targetscan軟件分析結果，FGFRL1的3′-UTR有2處潛在的miR-107結合位點，如圖3A所示，并且熒光素酶報告實驗驗證了FGFRL1與miR-107的靶標關系。結果表明，與共轉染pEZX-MT05-WT/miR-107 mimic NC組(1.11±0.04)相比，共轉染pEZX-MT05-WT/miR-107 mimic組的熒光素酶的相對活力(0.50±0.04)顯著降低(P<0.05)，但是在pEZX-MT05-MUT突變表達載體的共轉染mimic NC組與miR-107 mimic組之間，熒光素酶的相對活力(1.08±0.04 vs 1.00±0.06)沒有明顯差別(P>0.05)，證明miR-107與FGFRL1之間有靶向結合位點。與mimic NC組和NC組相比，miR-107 mimic組和siFGFRL1組的FGFRL1 mRNA和蛋白表達水平均顯著下調約5倍(圖3B、表2)。表明在胃癌SGC-7901/5-Fu細胞中miR-107可以調控FGFRL1的表達，FGFRL1是miR-107的下游靶標分子。

A.在FGFRL1的3′-UTR預測的2處miR-107結合位點；B.Western印跡檢測7901/5-FU細胞各處理組FGFRL1蛋白表達水平。1～4:mimic NC組、miR-107 mimic組、NC組、siFGFRL1組；圖4B同

表2 SGC-7901/5-FU細胞各組FGFRL1蛋白及mRNA表達水平

2.4miR-107通過抑制FGFRL1/AKT活性調節遷移相關蛋白的表達 與SGC-7901敏感株細胞相比，SGC-7901/5-Fu耐藥株細胞FGFRL1呈明顯高表達，耐藥株細胞中AKT的活性(p-AKT水平)明顯升高，遷移相關蛋白Vimentin和MMP9明顯高表達，而E-Cadherin呈明顯低表達(P<0.05)，見圖4A。說明SGC-7901/5-Fu耐藥株細胞具有更強的遷移能力。與mimic NC組和NC組相比，在miR-107 mimic組和siFGFRL1組中FGFRL1、AKT活性及Vimentin和MMP9蛋白表達水平顯著下調，而E-Cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.05)，見圖4B、表3。表明miR-107通過靶向FGFRL1調節AKT的活性，調控下游遷移相關蛋白的表達水平，影響耐藥腫瘤細胞的遷移。

A.Western印跡檢測胃癌SGC-7901敏感株細胞和SGC-7901/5-FU耐藥株細胞中相關蛋白的表達水平；1～2：SGC-7901、SGC-7901/5-FU；B.轉染處理后，Western印跡檢測SGC-7901/5-FU耐藥株細胞中相關蛋白的表達水平

表3 胃癌SGC-7901、SGC-7901/5-FU細胞中相關蛋白表達水平

2.5過表達miR-107和敲減FGFRL1對SGC-7901/5-Fu細胞轉移的影響 miR-107 mimic組和siFGFRL1組與其對照的mimic NC組和NC組相比，SGC-7901/5-Fu耐藥細胞劃痕愈合距離和穿過小室細胞數量均顯著減少，遷移水平顯著抑制(P<0.05)，見表4、圖5。表明敲低FGFRL1的表達可以明顯抑制耐藥株細胞轉移，而過表達miR-107則可以下調FGFRL1表達，進而抑制SGC-7901/5-Fu轉移。

表4 SGC-7901/5-FU細胞各組細胞遷移

圖5 劃痕和Transwell實驗檢測過表達miR-107和敲減FGFRL1抑制SGC-7901/5-FU細胞遷移(結晶紫染色，×200)

3 討 論

在現階段胃癌的臨床治療過程中，化療藥物耐藥的現象頻繁發生，并且耐藥的胃癌細胞有更強的遷移能力，腫瘤細胞的強轉移能力大大降低了患者的存活時間。雖然已有很多報道研究了各種腫瘤細胞轉移機制及調控因素，但對耐藥腫瘤細胞轉移的研究并不多見，因此，探究調控耐藥胃癌細胞遷移的分子機制能對進一步改善胃癌的臨床治療提供參考靶點。已有報道表明miRNA-107在多種疾病的發生中起到調節作用，如關節炎、阿爾茨海默病等〔14，15〕，尤其對腫瘤細胞而言，miRNA-107在其生長、藥物敏感性及遷移方面起重要的調節作用〔8～10〕。由于miR-107對多種腫瘤細胞增殖和轉移過程有重要的調節作用，可推測miR-107可能在調節耐藥胃癌細胞遷移中起調控作用。本研究結果說明，miR-107確實可以調控耐藥胃癌細胞的遷移。

由于FGFRL1的胞內結構域與成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)家族的其他受體不同，其C端不包含酪氨酸激酶區域，其功能也與經典的成纖維細胞生長因子(FGF)/FGFRs通路不同〔16〕。雖然已有研究表明，FGFRL1會影響細胞的一些生物學功能，但其對腫瘤細胞的調節作用并不十分清楚，有待深入探究〔17〕。有文獻表明，miR-107在非小細胞肺癌中可以通過調控FGFRL1的表達調控細胞增殖〔18〕。但在胃癌細胞中，miR-107是否靶向FGFRL1基因，調控FGFRL1的表達及miR-107調控胃癌細胞遷移的作用是否通過FGFRL1介導都鮮有報道。經生物信息學預測，熒光素酶報告實驗鑒定及過表達miR-107后，檢測FGFRL1 mRNA和蛋白表達水平，結果表明miR-107可以靶向調控FGFRL1的表達，FGFRL1是miR-107的分子靶標，且過表達miR-107和敲低FGFRL1后，耐藥細胞的遷移能力極顯著的被抑制，驗證了miR-107調控耐藥胃癌細胞的遷移是通過FGFRL1介導的。就作用機制而言，有文獻研究表明，FGFRL1可以通過調控磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信號調節小細胞肺癌化療耐藥的現象〔19〕，但FGFRL1是否通過調節AKT活性影響腫瘤細胞的遷移，尤其是對胃癌細胞轉移的調節，并沒有相關報道。而本研究新發現，改變miR-107或FGFRL1表達后，可以調節AKT的活性進而影響了一些遷移相關蛋白的表達，最終影響了胃癌耐藥細胞的遷移。