電針對缺氧缺血性腦損傷小鼠抗神經細胞凋亡及促進神經可塑性的作用機制

喬梁 李榮霞 胡山崗

(1河南省中醫院，河南 鄭州 450002；2青海省人民醫院)

在我國，缺氧缺血性腦損傷(HIBI)可導致不同程度神經功能障礙〔1〕。神經功能障礙的主要原因有氧化應激、自由基損傷、神經細胞凋亡、細胞毒性等〔2，3〕。電針是在傳統的針灸基礎上進行改革創新，是利用結合電刺激發展起來的一種治療技術。電針對腦缺氧缺血后導致的半暗帶有很好的修復作用，改善腦能量代謝，并能明顯改善患者后期的恢復情況，非常具有臨床價值〔4〕。轉錄因子NF-E2相關因子(Nrf)2介導的信號通路是機體防御性抗氧化的重要通路，Nrf2可以對細胞抗氧化反應進行調節，并與抗氧化反應元件(ARE)共同作用對抗氧化應激過程〔5〕，在生物體中的防御抵抗機制中扮演著舉足輕重的作用〔5〕。本研究探討電針法對HIBI雄性小鼠抗神經細胞凋亡及促進神經可塑性的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 80只雄性SPF級C57BL/6小鼠購于河南省康華藥業股份有限公司(許可證號：SYXK(豫)2017-0015)，體重(18±3)g，在本院動物實驗中心進行飼養，自由飲食，實驗中心的環境溫度為(24±3)℃，相對濕度(50±5)%，每天12 h循環光照。

1.2藥品與主要試劑 PowerLab生理記錄儀(澳大利亞AD Instruments公司)，韓氏電針儀HANS-200(南京濟生醫療科技有限公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，水迷宮(東樂自然基因生命科學公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC,美國Sigma公司，批號：T8877-25G)；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)測定法試劑盒(美國Sigma公司，批號：S7110)，Nrf2 inhibitors(美國TargetMol公司，批號：M00240)，反轉錄試劑盒(美國Sigma公司，批號：K1622)，Trizol 試劑盒(TaKaRa，批號：9108-1)，全蛋白抽提試劑盒(德國QIAGEN公司，批號：37901)，Western印跡試劑盒(美國BD公司，批號：SNM464)。

1.3動物模型建立及分組 將實驗小鼠隨機分為假手術組、模型組、電針組和電針+Nrf2 inhibitors組，每組20只。根據參考文獻中描述的Rice法建立HIBI模型〔6〕，對模型組、電針組和電針+Nrf2 inhibitors組建立模型：用戊巴比妥鈉對小鼠進行麻醉，仰臥法固定，在頸中部消毒切開，分離左頸總動脈，采用4-0號手術線進行血管結扎，縫合傷口；2 h進行恢復后，將實驗小鼠放入37℃水浴中進行密閉缺氧環境處理，給予8%O2+92%N2混合氣體進行缺氧處理持續2.5 h。假手術組僅進行手術后縫合，不對其進行血管結扎和缺氧處理。參考《實驗針灸學》，電針組選取部位為“內關”穴，雙極電針為0.28 mm×25 mm的針灸針制成，針刺深度為1～2 mm，電針參數為：2 Hz/100 Hz，電流終刺激強度為2 mA，治療時間20 min，每天治療2次，持續5 d。電針+Nrf2 inhibitors組在電針刺激結束后，向小鼠腹腔注射Nrf2 inhibitors(ML385)30 mg/kg，1次/d，持續5 d。造模成功標準：模型組小鼠的神經功能評分≥2分。

1.4小鼠神經功能評分 采用盲法進行小鼠的神經功能評分。根據Bederson法〔7〕，抓取小鼠尾巴并把它抬高至離桌面10 cm處，觀察各組小鼠形態并打分。標準：0分：前肢是伸展狀態(無神經功能損傷)；1分：對側腕、肘屈曲，肩內收屈曲；2分：前肢抵抗對側推力的能力水平下降；3分：對側轉圈。

1.5小鼠空間學習記憶能力考察 干預結束7 d后，隨機從每組中取6只實驗小鼠，采用Morris水迷宮檢測方法對實驗小鼠的空間學習記憶能力進行檢測。其中前5 d進行平臺訓練：平臺高30 cm、直徑12 cm，然后放于迷宮的其中1個象限中，放入的水下深入為水下1 cm處；然后將小鼠分別放于4個方向，分5次進行3 min的探索直至找到平臺，以小鼠到達平臺的時間作為逃避潛伏期；若小鼠在2 min內沒有找到平臺，則被引導至平臺停留15 min。從第6天開始為空間搜索階段：將平臺進行移除，把小鼠放入水迷宮中，同樣的方法進行2 min的測試，以穿過平臺位置的次數作為穿臺指數。利用MT-200 Morris自動跟蹤系統軟件對實驗小鼠的實驗情況進行記錄，以此來分析逃避潛伏期和穿臺指數。

1.6小鼠腦組織梗死情況觀察 干預結束后，隨機從每組中另取4只實驗小鼠斷頭處死，取出腦組織，放入4℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)中進行5 min冷卻處理，然后進行切片，厚度為2 mm。然后將切片浸入2%的TTC溶液中(35℃恒溫，30 min)，用4℃的PBS進行2次清洗，隨后進行10%甲醛溶液固定，掃描拍照。紅色部位是正常的腦組織，白色部位是梗死區域的腦組織。采用Image J軟件統計測量切片腦組織梗死面積，梗死面積比為梗死面積占同側缺血腦組織總面積的百分比。

1.7海馬區腦組織神經細胞凋亡情況觀察 干預后，隨機從每組中另取10只實驗小鼠斷頭處死，取實驗小鼠海馬區腦組織，進行4%多聚甲醛固定，石蠟包埋處理后進行切片處理(厚度為4 μm)，之后進行脫蠟，染色，脫水，透明，封片。采用TUNEL染色法對腦組織細胞凋亡進行檢測。TUNEL陽性細胞核呈現棕褐色，鏡下觀察時隨機選取5個視野(×400)，凋亡率=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.8RT-qPCR檢測mRNA的表達 依據Trizol法提取各組樣本的總RNA，使用引物如下：B細胞淋巴瘤(Bcl)-2：上游引物：5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′，下游：5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-9：上游引物：5′-CTTCGTTTCTGCGAACTAACAGG-3′，下游：5′-GCACCACTGGGGTAAGGTTT-3′;Bcl-2相關X蛋白(Bax)：上游引物：5′-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′，下游：5′-CCAG CCCATGATGGTTCTGAT-3′，β-actin：上游引物：5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACT-3′，下游：5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′。反應條件：75℃預變性，2 min，進入以下循環90℃變性，5 min；60℃退火，60 s；72℃延伸，30 s；共40個循環。相對表達量用2-ΔΔCT表示。獨立重復實驗3次。

1.9免疫組化檢測Nrf2和血紅素加氧酶(HO)-1 表達 組織切片進行脫蠟至水，然后再PBS溶液中進行修復，室溫下3%的過氧化氫浸泡，封閉，然后進行一抗4℃孵育過夜，第2天用PBS清洗3次，加入二抗，室溫孵育30 min，PBS清洗3次。加二氨基聯苯胺(DAB)孵育5 min，去離子水終止反應，然后用蘇木素復染5 min，清洗后進行不同濃度梯度的乙醇脫水2 h，中性樹膠封片，最后用光學顯微鏡觀察并拍照。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400)，每個視野內計數100個細胞中陽性細胞數，陽性細胞為細胞出現棕黃色或棕褐色顆粒。

1.10Western印跡檢測堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、突觸后密度蛋白(PSD)95和突觸小泡蛋白(SYP)表達 分別收集各組樣本，用總蛋白提取試劑盒提取每組中的總蛋白，二喹啉甲醛(BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。制備蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，加含有5%牛血清白蛋白(BSA)的封閉液室溫條件下封閉2 h。加入一抗在4℃條件下封閉過夜。次日用緩沖液清洗PVDF膜3次，然后加入二抗，室溫孵育1 h后，加入顯色液曝光顯影。

1.11統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗，作圖工具采用Graphpad5.01軟件。

2 結 果

2.1小鼠神經功能評分 與假手術組(0分)相比，模型組神經功能評分〔(2.6±0.75)分〕明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組神經功能評分〔(0.8±0.12)分〕明顯降低(P<0.05)；電針+Nrf2 inhibitors組神經功能評分〔(1.8±0.37)分〕明顯低于模型組，明顯高于電針組(P<0.05)。

2.2小鼠空間學習記憶能力 水迷宮實驗結果顯示在平臺訓練階段，隨著訓練時間的推移和次數的增加，模型組、電針組、電針+Nrf2 inhibitors組逃避潛伏期逐漸縮減(均P<0.01)；與假手術組相比，模型組逃避潛伏期在各時間點均顯著變長(P<0.05)；與模型組相比，電針組逃避潛伏期在各時間點均顯著變短；電針+Nrf2 inhibitors組逃避潛伏期較模型組明顯縮短，較電針組明顯延長(P<0.05)。在空間搜索階段，與假手術組相比，模型組穿臺指數顯著降低；與模型組相比，電針組穿臺指數顯著升高，電針+Nrf2 inhibitors組穿臺指數明顯高于模型組，明顯低于電針組(P<0.05)。見表1。

表1 各組逃避潛伏期和穿臺指數比較

2.3電針對小鼠腦組織梗死的影響 假手術組腦組織呈紅色，無白色區域，表明無梗死現象發生；與假手術組相比，模型組腦組織中的白色梗死區域明顯變大，梗死面積比顯著上升；與模型組相比，電針組腦組織的白色梗死區域面積明顯縮小，梗死面積比顯著降低；電針+Nrf2 inhibitors組白色梗死區域面積介于模型組和電針組之間，以上差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表2。

2.4電針對小鼠神經細胞凋亡的影響 假手術組未見TUNEL陽性細胞，與假手術組相比，模型組的腦組織切片中TUNEL陽性細胞數量顯著增多，細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組TUNEL陽性細胞數量顯著減少，細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；電針+Nrf2 inhibitors組腦組織切片中TUNEL陽性細胞數量，細胞凋亡率明顯低于模型組，明顯高于電針組(均P<0.05)。見表2、圖2。

圖1 各組腦組織的TTC染色(×10)

表2 各組腦組織梗死面積比、細胞凋亡率結果及Bax、Caspase-9、Bcl-2的mRNA表達量比較

圖2 各組腦組織(TUNEL染色，×400)

2.5Bax、Caspase-9、Bcl-2 mRNA表達 與假手術組比較，模型組Bax和Caspase-9 mRNA表達明顯升高，Bcl-2 mRNA表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，電針組Bax和Caspase-9 mRNA表達明顯降低，Bcl-2 mRNA表達明顯升高(P<0.05)；電針+Nrf2 inhibitors組中Bcl-2、Bax和Caspase-9 mRNA表達水平介于模型組和電針組之間，組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.6免疫組化檢測Nrf2和HO-1表達 與假手術組相比，模型組中Nrf2和HO-1蛋白陽性細胞數明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組Nrf2和HO-1蛋白陽性細胞數明顯升高(均P<0.05)；電針+Nrf2 inhibitors組中Nrf2和HO-1蛋白陽性細胞數介于模型組和電針組之間，組間差異均有統計學意義(均P<0.05)，見表3，圖3。

2.7bFGF、BDNF、PSD95 和 SYP 蛋白表達量檢測結果 與假手術組相比，模型組腦組織中bFGF、BDNF、PSD95和SYP蛋白表達水平均明顯下調(P<0.05)；電針組中上述蛋白的表達水平較模型組均明顯上調；電針+Nrf2 inhibitors組中bFGF、BDNF、PSD95和SYP蛋白表達水平介于模型組和電針組之間，組間差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4，表3。

表3 各組Nrf2和HO-1陽性染色細胞數量、bFGF、BDNF、PSD95和SYP蛋白表達比較

圖3 Nrf2和HO-1海馬區腦組織中的表達變化(免疫組化，×400)

1～4：假手術組、模型組、電針組、電針+Nrf2 inhibitors組

3 討 論

電針是近些年來在傳統針灸技術基礎上通過改革創新而發展起來的一種治療技術，利用結合電刺激方式被廣泛地應用于臨床治療中，尤其是在缺氧缺血性腦損傷及神經損傷恢復等方面引起廣泛關注〔8〕。劉波等〔9〕研究發現，電針法發揮腦保護效應可能是通過減少自由基和抑制大腦皮質內凋亡誘導因子，進而對受損的神經細胞進行改善和修復。然而，目前關于電針治療腦缺氧缺血的具體作用機制尚不十分清楚〔10〕。本研究結果證明，電針可對HIBI小鼠的神經功能損傷具有改善效果。

研究表明，當小鼠腦組織發生缺氧缺血損傷時，神經細胞由于會產生活性氧和自由基等，最終將會使神經細胞發生凋亡〔11〕。其中Bcl-2、Caspase-9及Bax是與細胞凋亡息息相關的基因，通過激活Caspase-9和Bax可以促進細胞凋亡，而Bcl-2可以抑制細胞凋亡〔12〕。馬競等〔13〕通過構建HIBI小鼠模型指出，黨參多糖可以通過調控Bax和Bcl-2等細胞凋亡相關的基因表達來抑制HIBI所導致的神經細胞凋亡。本研究結果表明，電針可以降低HIBI小鼠腦組織的神經細胞凋亡。

Nrf2信號通路在抗氧化還原、氧化應激等方面具有非常重要的作用〔14〕，Nrf2是在細胞進行氧化應激過程中的關鍵因子，通常情況下Nrf2與Keap1在細胞質中結合，此時是未激活狀態；當受到刺激被激活時，Keap1-Nrf2結合體變得不穩定，Keap1發生降解，Nrf2被釋放出來轉移到細胞核內，促進下游GST、HO-1或NQO1等一系列啟動保護性蛋白基因的表達〔15〕。Gao等〔16〕發現，通過對Nrf2/HO-1通路進行調控，可以減輕HIBI模型大鼠的氧化應激和炎癥反應，提示Nrf2/HO-1通路的神經保護作用潛力。研究表明，電針可以促進Nrf2和ARE的表達，從而啟動細胞氧化應激機制〔17〕。本研究結果可能與HIBI模型小鼠抗氧化還原、氧化應激有著密切關系。神經生長因子對中樞和外周神經元的生長發育分化具有促進作用，維持神經系統的正常功能，加快神經功能損傷后的修復〔18〕。bFGF和BDNF是神經生長因子家族的一種，能促進神經細胞增殖、生長、分化，促進缺氧缺血性腦損傷修復〔19〕，PSD95和SYP也是突觸后信號轉導和整合的關鍵物質，與HIBI也密切相關〔20〕。Sheng等〔21〕指出，BDNF-TrkB途徑可以通過穩定離子穩態、抑制興奮性遞質釋放和減弱中斷的神經元傳遞來保護神經元，對HIBI具有神經可塑性；鄔春久等〔22〕則表明，上調PSD95蛋白表達對HIBI具有改善作用。本研究表明電針可以促進HIBI模型小鼠的神經可塑性，進一步發揮神經保護作用。