酒精浸泡冷藏鮮印度塊菌貨架期評估、揮發性物質與細菌群落變化及其相關性

黎 琦，鄒璐潞，馬沁沁，朱 林，何淑豪，梁詩慧，苗玉志

（四川師范大學生命科學學院，四川 成都 610100）

鮮印度塊菌（Tuber indicum）因其營養豐富、芳香濃郁并富含抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗抑郁和免疫調節等生物活性物質被譽為“餐桌上的鉆石”“地下黃金”，是世界上最美味、最珍貴的食用菌之一，受到國內外消費者的青睞，且由于國內外市場價格高而具有極大的經濟價值[1-4]。但塊菌生長環境的特殊性和子囊果內部結構的獨特性造就了成熟塊菌子囊果內含大量的微生物[5]，加之采后旺盛的新陳代謝和呼吸作用，使得塊菌在新鮮時極易腐爛變質，失去營養作用和經濟價值[6]，而傳統的凍藏技術會導致塊菌解凍后芳香物質大量流失和質地軟化，所以實現鮮印度塊菌采后貯藏保鮮，有效延長其貨架期，是塊菌產業可持續發展的必經之路。

國內外學者已就黑孢塊菌（Tuber melanosporum）、夏塊菌（T.aestivum）、白塊菌（T.magnatum）以及印度塊菌（T.indicum）等不同種塊菌的貯藏保鮮技術進行了研究，在已有報道中，多以添加劑處理結合氣調或真空包裝保藏為主，如Elena等[7]利用質量濃度2.5 mg/mL沒食子酸處理黑孢塊菌后置于4 ℃冷藏保鮮，其貨架期可達28 d；Choo等[8]采用質量濃度400 mg/L殼聚糖-納他霉素對鮮澳大利亞黑塊菌進行涂膜處理，有效降低了塊菌微生物數量，將貨架期延長至28 d；Sara等[9]采用復配的混合氣體于聚丙烯容器中30 kPa氣壓包裝鮮黑孢塊菌后冷藏，其貨架期延長至28 d。研究表明，采用復合食品添加劑處理鮮印度塊菌后真空包裝并于4 ℃貯藏其貨架期延長至49 d[9-10]。但這些技術多存在處理和包裝工序復雜以及設備要求高等問題，難以在日常生活中得以有效應用，從而限制了鮮印度塊菌的消費。因此，開發一個簡單易行且能有效延長鮮印度塊菌貨架期的貯藏保鮮技術，不僅能保存鮮印度塊菌的營養價值而且能促進鮮印度塊菌的消費[11]。

鮮印度塊菌貯藏保鮮技術研發過程中，塊菌的感官、微生物數量、營養組分以及芳香物質常被用作塊菌新鮮度、安全性的重要指標，而其中塊菌的揮發性物質尤其重要。研究表明，大多塊菌揮發性芳香成分由大約56 種芳香物質組成，其中11～13 種處于嗅覺可感知的水平[12-14]，而未經處理的鮮印度塊菌在貯藏保鮮過程中其揮發性芳香物質含量會不斷下降而腐敗類異味物質含量持續增加，雖然變化機制尚不完全清楚，但豐富的內生微生物群落可能參與了這一過程[15-16]，并與塊菌貯藏期間產生的腐敗類異味物質，如三甲基胺和2-甲基異茨醇等相關[17]。但關于鮮印度塊菌貯藏保鮮過程中營養組分、揮發性物質和細菌群落在冷藏過程中的變化規律及其相關性迄今未知。

本實驗以鮮印度塊菌為原料，經過溫開水清洗、食用酒精速泡和4 ℃冷藏等工序處理，以感官評價為標準研究簡單有效并能提升鮮印度塊菌貨架期的冷藏技術，并深入分析鮮印度塊菌冷藏期間營養組分、揮發性物質和細菌群落變化及相關性，以期為進一步研究鮮印度塊菌腐敗機制和貯藏保鮮新技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮印度塊菌采挖于四川攀枝花3 個塊菌自然產區，每個產區各約1000 g。采挖后立即用無菌濕巾紙單個包裹后置于裝有冰袋的隔熱泡沫盒中2 d內運回實驗室，置于4 ℃冰箱備用。

葡萄糖 成都曼思特公司；苯酚、氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、鹽酸、甲基紅、亞甲基藍、仲辛醇等常規化學試劑（均為分析純）、食用酒精（食品級） 成都科龍化工試劑廠；瓊脂 青島海博生物公司；Qubit dsDNA Assay Kit試劑盒 美國Life Technologies公司；Tks Gflex DNA ploymerase試劑盒美國Takara公司。

1.2 儀器與設備

GI100DS型自動高壓蒸汽滅菌鍋 美國Zealway公司；THZ-98A型恒溫振蕩培養箱 上海一恒科技公司；K9840型全自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份公司；Intuvo 9000/5977B型氣相色譜/單四極桿氣相色譜質譜聯用系統、PAL型自動進樣器和PDMS/DVB型自動固相微萃取頭 美國Agilent公司；2500型凝膠成像儀北京Tanon公司；MiSeqPE300 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 冷藏塊菌樣品的制備

在充分預實驗的基礎上制備：從每個產區挑選成熟度和大小基本均勻一致的塊菌各16 個，用潤濕的軟毛刷除凈子囊果表面的泥土，于溫開水中淘洗干凈并于通風櫥中風干表面水，置于體積分數75%食用酒精溶液中浸泡消毒30 s，立即用溫開水沖洗子囊果5 次再風干表面水。分別將每個子囊果切分成1/9大小（基于9 個時間點取樣分析），混合均勻后均分到9 個無菌聚乙烯袋（20 cmh 22 cm）內真空包裝后于4 ℃冷藏保鮮，貯藏環境的相對濕度控制在76%～80%，分別于冷藏的0、8、15、20、25、30、33、36 d和38 d取樣，進行感官評定、營養和揮發性物質含量分析，同時采用16S rRNA高通量測序技術測序，以不浸泡處理的鮮印度塊菌作為對照，每樣進行3 個平行實驗。

1.3.2 感官評定

感官評定采用9 分制評分標準，具體方法參考Rivera等[18]的評定標準稍作修改。由9 名經過專業訓練的評定人員（包含3 名行業專家）組成評價小組，通過擠壓質地、嗅聞香氣、舌嘗風味和眼觀樣品內部顏色和紋理，并綜合評價各個樣品的可接受程度，評分標準見表1。

表1 鮮印度塊菌感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fresh truffles

1.3.3 營養組分和質量損失率測定

取待測樣品用無菌刀將其切碎，凍干至恒質量、粉碎、過60 目篩，裝入清潔的廣口瓶密封，放入干燥器內備用。總糖含量的測定參照GB/T 15672-2009《食用菌中總糖含量的測定》，蛋白質含量測定參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》，粗纖維含量的測定參照GB 5009.88-2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》。冷藏期間塊菌質量損失率通過塊菌貯藏前后的質量變化計算[19]，如公式（1）所示。

1.3.4 揮發性物質分析

1.3.4.1 頂空固相微萃取提取

準確稱量塊菌各凍干樣品2.0 g進行如下操作，將樣品置于20 mL頂空硅膠隔墊進樣瓶中，加入10 μL用超純水稀釋的仲辛醇溶液（質量濃度0.52 μg/μL）作為內標，將頂空瓶置于53 ℃水浴鍋中平衡45 min，將老化后的萃取頭插入頂空進樣瓶中，頂空吸附40 min后通過PAL自動進樣器進樣并采用氣相色譜/單四極桿氣相色譜質譜聯用系統進行測定[20]。

1.3.4.2 氣相色譜-質譜分析

色譜柱為HP-INNOWax 毛細管色譜柱（30 mh 250 μmh 0.25 μm）；進樣口溫度240 ℃，解吸時間5 min，采用不分流模式進樣。升溫程序：50 ℃保持5 min，3 ℃/min速率升溫至185 ℃，10 ℃/min速率升溫至200 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升溫至250 ℃并保持3 min。載氣為高純氦氣，柱流速1 mL/min，進樣量1.0 μL，不分流。質譜條件：檢測器單四極桿，電子轟擊EI離子源，電子能量70 eV，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲0 min，全掃描信號采集，掃描范圍m/z20～550，掃描速率781 u/s。通過計算機標準譜庫（NIST 2017）比較分析塊菌的揮發性物質，選擇匹配度大于80%的物質并結合安捷倫質譜系統進行定性分析；數據定量分析采用內標法半定量分析，按照公式（2）計算各樣品揮發物質的含量[20]。

1.3.5 高通量測序

將制取的不同冷藏時間鮮印度塊菌樣本用干冰包裝送至上海派森諾生物科技有限公司，基于Illumina MiSeq平臺進行高通量測序，細菌多樣性鑒定對應測序區域為16S V3～V4區。實驗操作參考趙萍等[21]描述的方法進行。

樣本α-多樣性分析：1）Sobs稀釋性曲線，稀釋性曲線根據個體數量和物種數量構建曲線，用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度，也用于指示測序數據量是否合理。利用Mothur軟件做Rarefaction分析，R語言繪圖；2）微生物多樣性是在生物群落水平上進行研究的，通過對單樣本的菌群豐度指數（Chao1指數）和菌群多樣性指數（Shannon、Simpson指數和Coverage指數）進行研究，可以反映微生物群落的豐度和多樣性；3）Shannon指數用于反映各樣本在不同測序量下各樣品的微生物多樣性。利用Mothur軟件計算不同隨機抽樣下的Shannon指數，并用R語言繪圖；4）主成分分析（principal component analysis，PCA），通過分析不同樣本的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）（97%相似性），使用R語言作二維坐標圖，可以反映樣本間的差異和距離。

1.4 數據統計與分析

高通量測序完成后，對原始雙端系列去雜，利用Flash軟件進行拼接，然后利用Uchime軟件檢測并去除序列中的嵌合體。有效序列采用Vsearch軟件，根據序列的相似性，將相似度≥97%的序列歸為多個OTU，使用Qiime軟件包挑選出各個OTU的代表序列，并將所有代表序列與數據庫進行對比注釋。基于分類信息學信息，探討鮮印度塊菌冷藏期間細菌群落結構變化。使用Excel軟件對原始數據進行處理、匯總，采用SPSS 26軟件進行顯著性分析，其中多重比較采用鄧肯法，P＜0.05、P＜0.01分別表示差異顯著和極顯著，利用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 感官評定結果

按照評分標準對不同冷藏時間的實驗組和對照組樣品進行感官評定，結果見圖1A、C（單項得分）和圖1B、D（總分）。由圖1A可知，與貯藏0 d相比，冷藏15 d實驗組塊菌的質地、香氣、風味和內部紋理得分下降顯著（P＜0.05），15 d時實驗組總得分37.00 分，但仍符合一級新鮮A，而對照組貯存30 d時樣本總得分下降極顯著（P＜0.01），總得分為9.33 分，達到腐敗標準，因而對15 d后的對照組樣本不再繼續研究；實驗組樣本30 d時質地、香氣、風味和內部紋理得分變化與0 d相比差異極顯著（P＜0.01），總得分降到19.00 分，品質降到二級新鮮度B；在冷藏31～38 d時，塊菌質地極軟，基本沒有塊菌的香氣和風味，內部顏色和大理石紋理消失，33 d時各項指標總得分降到12.09 分，達到腐敗程度C，因而通過感官預測得到鮮印度塊菌貨架期為30 d，這同采用食品添加劑復合處理真空包裝鮮印度塊菌冷藏貨架期短19 d[10]，比采用輻射處理氣調包裝冷藏的貨架期短12 d[22]，比其他冷藏保鮮技術的28 d長2 d[9]。綜上，經感官評定鮮印度塊菌在冷藏過程中歷經一級新鮮A（0～15 d）、二級新鮮B（6～30 d）和腐敗C（31～38 d）3 個階段。

圖1 鮮印度塊菌冷藏期間的感官單項得分和總得分Fig.1 Sensory scores of fresh Tuber indium pretreated and not pretreated with alcohol during cold storage

2.2 營養組分和質量損失率變化

對各樣品的總糖、總蛋白、粗纖維含量和質量損失率分析結果見圖2，在冷藏15 d時，與0 d相比總糖相對含量由38.9%下降到31.1%（P＜0.01），而15～30 d內，由31.1%下降到30.9%；總蛋白相對含量在0、15 d和30 d時分別為23.3%、22.9%和21.8%，但在38 d時，相對含量減少到17.1%（P＜0.05）；粗纖維相對含量在0、15 d和30 d時分別為43.9%、42.8%和41.4%，到38 d時粗纖維相對含量為36.8%，與0 d相比下降顯著（P＜0.05）；塊菌質量損失率從0 d的2.55%升到38 d的6.95%，差異顯著（P＜0.05）。Saltarelli等[23]研究發現白塊菌、黑孢塊菌和夏塊菌的總蛋白相對含量沒有受到貯藏條件的影響，而波氏塊菌的總蛋白在冷藏30 d時含量顯著減少，說明塊菌冷藏過程中蛋白質含量變化同塊菌品種相關。鮮印度塊菌在冷藏的0～38 d內，總糖、總蛋白、粗纖維相對含量以及質量損失率分別在0～15、15～30 d和30～38 d呈階段性變化，這進一步印證了感官評定結果的準確性。

圖2 鮮印度塊菌冷藏過程中營養組分和質量損失率變化Fig.2 Changes in nutritional components and mass loss percentage of fresh Tuber indium during cold storage

2.3 揮發性物質變化

2.3.1 揮發性芳香和異味物質

通常情況下，揮發性芳香化合物對塊菌香氣的貢獻由其含量和氣味閾值共同決定，含量高的揮發性芳香物質對塊菌的風味具有重要作用，但一些含量低且氣味閾值也低的化合物可能對塊菌整體風味也具有顯著促進作用[24]。基于揮發性物質的離子流圖，從樣本中共檢測到67 種揮發性物質（圖3A），其中揮發性芳香物質合計38 種（圖3B），包括12 種酯類、9 種醇類、8 種醛類、5 種醛酮類、2 種酸類以及2 種其他類化合物，變化趨勢為從0 d的38 種減少到15 d的17 種，到38 d時僅有7 種被檢出且含量極低；而1-辛烯-3-醇是印度塊菌香氣中最重要的揮發性物質之一，也是印度塊菌“蘑菇味”最主要的來源[25]，從冷藏0 d的塊菌中檢出0.43 μg/g 1-辛烯-3-醇，而在15 d后未檢出，對鮮印度塊菌香氣貢獻程度較大的揮發性物質還有1-辛烯-3-酮、苯甲醛、己醛、2-辛酮等[26]在0 d的樣本中均檢出，但隨著冷藏時間的延長，其含量下降明顯，到30 d時均未檢出。二甲基硫醚被認為是塊菌最重要和特有的芳香化合物，能呈現塊菌獨特的香氣[27]。Richard等[28]研究表明二甲基硫醚對黑孢塊菌和意大利白塊菌的芳香品質貢獻程度最大，但本研究在印度塊菌中未檢出二甲基硫醚，而Zhang Bo等[29]則在新鮮印度塊菌中檢測到該物質的存在，分析認為酒精處理可能對印度塊菌中二甲基硫醚有影響，這一結論有待進一步驗證。

由圖3C可知，“不愉快”“刺激性”的揮發性異味物質從塊菌冷藏15 d的1 種持續增加，至38 d時增加到24 種；從含量方面看，3-甲基-1-丁醇自第8天開始出現，貯藏30 d增加到13.55 μg/g，再增加到38 d的40.52 μg/g；乙酸含量由2.06 μg/g（8 d）增加到10.44 μg/g（25 d），再到14.77 μg/g（36 d）；二甲醚含量由0.22 μg/g（8 d）增加到13.30 μg/g（25 d），再到31.72 μg/g（36 d）；3-甲基丁酸含量由0.15 μg/g（8 d）增加到3.39 μg/g（25 d）再增加到8.81 μg/g（36 d）；另外，具有酸敗味的庚醛、“不愉快的干椰肉油氣味”的己酸以及“腥臭味”的吡啶[24]，分別從0 d的0 μg/g增加到30 d的1.15、0.30 μg/g和0.99 μg/g，在38 d時分別達到1.31、1.31 μg/g和1.61 μg/g；此外，還有多達17 種異味物質在30 d后才檢出，其出現的原因可能和塊菌子囊果內大量存在的微生物有關[15-16]。另外，研究發現在冷藏過程中還存在含量基本保持不變的5 種揮發性物質，其出現的原因和在塊菌中的作用有待進一步研究。

圖3 鮮印度塊菌冷藏期間揮發性物質離子流圖（A）、含量下降（B）和上升（C）的揮發性物質Fig.3 Chromatogram (A) of volatile compounds from fresh Tuber indium,volatile compounds that decreased (B) and those that increased (C) during cold storage

2.3.2 揮發性物質的PCA結果

含量下降的揮發性芳香物質的PCA結果如圖4A所示，第一主成分（PC1）對原變量變化的解釋率為88.7%，第二主成分（PC2）對原變量變化的解釋率為7.8%，總解釋率為96.5%，解釋可信度極高，表明鮮印度塊菌在冷藏的0～20 d揮發性芳香物質種類多濃度較高是維護鮮印度塊菌芳香的主要因子；同樣，含量上升的揮發性異味物質PCA結果如圖4B所示，第一主成分（PC1）對原變量變化的解釋率為77.9%，第二主成分（PC2）對原變量變化的解釋率為14.9%，總解釋率為92.8%，解釋可信度較高，表明塊菌在冷藏0～15 d揮發性異味物質種類少濃度低對塊菌質量影響不明顯，在冷藏的20～30 d揮發性臭味物質出現并隨冷藏時間的延長而增多，在30 d后揮發性臭味物質種類多濃度高，對冷藏塊菌質量影響明顯。

圖4 鮮印度塊菌冷藏期間揮發性芳香物質（A）和異味物質（B）的PCA圖Fig.4 PCA plots of volatile aroma compounds (A) and odor compounds (B) in fresh Tuber indium during cold storage

2.4 細菌群落變化

2.4.1 細菌α-多樣性

采用16S rRNA Illumina Hiseq測序，從27 個樣品中共獲得1130829 條優化序列，每樣平均長度為41882，有效序列百分比達75%以上，表明樣本的有效序列滿足后續微生物多樣性分析要求。OTU分類表明它們分屬于21 個門、50 個綱、110 個目、216 個科、411 個屬和615 個種。根據97%相似度水平的OTU信息，通過Sobs、Chao1、Shannon、Ace指數和Simpson指數等對樣品的細菌α-多樣性進行評估，結果見表2，各個樣品的Coverage指數在99.66～99.82之間，表明樣品基因序列檢出數據可靠；各樣品的細菌α-多樣性指數組間差異不明顯，即在冷藏的0～38 d內細菌群落變化不明顯。進一步對各樣品的α-多樣性指數比較，發現隨著冷藏時間的延長，各樣本中的Sobs（OTU數目）、Chao1指數和Shannon指數呈下降趨勢，且從冷藏15 d后下降明顯，說明冷藏前期鮮印度塊菌細菌多樣性比冷藏后期更豐富。冷藏15 d后的樣本同冷藏30 d相比，各指數均有一定幅度的變化，根據各指數的變化特點，可將冷藏過程區分為冷藏前期（0～15 d）、冷藏中期（15～30 d）、冷藏后期（30～38 d），各時期之間細菌α-多樣性指數變化較明顯，這同感官評估獲得的一級新鮮度A、二級新鮮B和腐敗C 3 個階段相印證。

表2 鮮印度塊菌不同冷藏時間細菌α-多樣性指數Table 2 Alpha diversity indices of bacteria communities in fresh Tuber indium during cold storage

2.4.2 細菌群落變化

鮮印度塊菌冷藏期間細菌群落在門分類水平上相對豐度變化見圖5A，從各樣本中檢出的主要菌門有變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。絕對優勢菌門為Proteobacteria，相對豐度在76.28%～81.48%之間，從0 d的78.89%緩慢增加到30 d的81.48%，38 d時下降為80.98%；其次為Bacteroidetes，相對豐度在7.21%～19.78%之間，從0 d的10.86%緩慢增加到15 d的19.78%，38 d時下降為7.32%；Actinobacteria、Firmicutes和Verrucomicrobia的相對豐度在0.57%～7.41%之間，Actinobacteria從0 d的4.27%下降到15 d的2.13%，38 d時上升到7.41%；Firmicutes和Verrucomicrobia在冷藏期間變化不明顯；其他菌門相對豐度均小于1%。總體上，門水平上的Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Firmicutes和Verrucomicrobia是鮮印度塊菌冷藏中的優勢菌門，它們同冷藏期鮮印度塊菌品質密切相關，這和其他研究結果[30-31]基本一致。

為細化研究鮮印度塊菌不同樣品中細菌群落差異，進一步在屬水平上分析鮮印度塊菌冷藏過程中細菌群落多樣性，結果如圖5B所示，在冷藏的0～15 d內相對豐度最高的是慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium），相對豐度在18.72%～23.19%之間，從0 d的22.36%降到15 d的18.72%，25 d時上升到23.19%，而后保持穩定；其次是假單胞菌屬（Pseudomonas），相對豐度分別從0 d的4.23%開始一直上升，在30 d時達到最高的24.02%，而后保持穩定；根瘤菌屬（Rhizobium）從0 d的8.97%下降到25 d時的7.00%，在38 d時上升為7.87%；劍菌屬（Ensifer）、貪食菌屬（Variovorax）、Dyadobacter和地桿菌屬（Pedobacter）在0 d時相對豐度分別為3.10%、4.25%、1.57%和1.47%，在15 d時達到最高（6.81%，6.55%、5.47%和6.06%），此后一直下降，在38 d時分別為4.89%，3.65%、0.66%和2.98%；鞘氨醇桿菌屬（Chitinophaga）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、沙雷氏菌屬（Serratia）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）以及叢毛單胞菌屬（Comamonas）這些菌屬在冷藏的0～38 d間相對豐度為1%～2%；另外，包括壤霉菌屬（Agromyces）、博斯氏菌屬（Bosea）、假黃色單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）在內的6 個菌屬隨著冷藏時間的延長，其相對豐度逐漸降低，到20 d消失；其余屬相對豐度均小于1%。

圖5 樣本中細菌群落在門（A）和屬（B）水平上相對豐度分布Fig.5 Relative abundance of bacterial communities at phylum (A) and genus (B) level

2.5 相關性分析

相對豐度前10的細菌群落與各樣本營養組分、典型性揮發性物質含量的相關性分析見圖6，塊菌冷藏過程中各樣本分布情況為A階段樣本在0、8 d和15 d均分離，B階段各樣本在20 d和25 d重合但與30 d樣本分離，而C階段所有樣本在3 個時間點幾乎重合，這表明冷藏的A階段塊菌中細菌多樣性更高，到了冷藏的B和C階段細菌組成較為單一[32]。營養組分變化與細菌群落的PCA結果見圖6A，樣品總糖含量對細菌群落影響較大，其次是總蛋白含量和粗纖維含量，樣品質量損失率影響最小；相關性方面，A階段的總糖、總蛋白和粗纖維含量與Bosea、Janthinobacterium、Pedobacter、Dyadobacter、Variovorax、Bradyrhizobium、Ensifer與Rhizobium相對豐度呈正相關，Pseudomonas相對豐度與各樣本營養組分含量呈負相關；B和C階段時，Pseudomonas和Serratia相對豐度同各樣本質量損失率呈正相關。揮發性芳香物質變化與細菌群落的PCA結果見圖6B，樣品揮發性芳香物質同細菌群落的相關性主要集中在冷藏的A階段，這期間1-辛烯-3-醇、正戊酸正戊酯對細菌群落影響較大，其次是乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-辛酮、1-辛烯-3-酮、己醛、正己醇；上述所有芳香物質含量與Bradyrhizobium、Rhizobium、Bosea、Variovorax、Dyadobacter、Janthinobacterium、Pedobacter相對豐度均呈正相關，其中1-辛烯-3-醇、正戊酸正戊酯含量分別與Rhizobium、Bosea相對豐度有正相關性；Ensifer、Pseudomonas和Serratia相對豐度與所有揮發性芳香物質含量呈負相關。揮發性異味物質變化與細菌群落的PCA結果見圖6C，樣品揮發性異味物質同細菌群落的相關性主要集中在冷藏的C階段，其中吡啶、二甲醚、3-甲基丁酸、己酸、庚醛、巴豆醇、3-甲硫基丙醇以及3-甲基-1-丁醇含量同Ensifer、Pseudomonas、Serratia相對豐度呈正相關，而與Bradyrhizobium、Rhizobium、Bosea、Variovorax、Dyadobacter、Janthinobacterium和Pedobacter相對豐度呈負相關。冗余分析（redundancy analysis，RDA）結果印證了鮮印度塊菌冷藏期間所有營養組分含量、揮發性芳香物質含量的下降和異味物質含量的上升都與細菌群落存在較大的相關性，而且不同揮發性物質在不同冷藏時期關聯的細菌群落不同，這也反映了不同冷藏期樣品中細菌群落的差異性。

圖6 塊菌冷藏過程中營養組分（A）、芳香（B）和異味物質（C）變化與細菌群落屬水平冗余分析結果Fig.6 Redundancy analysis of nutrition components (A),aroma compounds (B) and odor compounds (C) versus bacterial communities at genus level in fresh Tuber indium during cold storage

3 結論

通過對75%食用酒精速泡、真空包裝、4 ℃冷藏期9 個時間點共27 個鮮印度塊菌樣品的感官評估，預測出其貨架期，并對冷藏期樣品的營養組分、揮發性物質和細菌群落變化及相關性進行分析，主要結論如下：1）預測得到酒精速泡處理的鮮印度塊菌貨架期為30 d；2）在0～38 d的冷藏期內營養組分總體變化規律為總糖相對含量由38.9%下降到30.9%，總蛋白相對含量由23.3%下降到17.1%，粗纖維相對含量由43.9%下降到36.8%，質量損失率從0 d的2.55%升到38 d的6.95%；3）冷藏期揮發性芳香物質從0 d的38 種減少到15 d的17 種，到38 d時僅有7 種存在；揮發性異味物質從塊菌冷藏15 d的1 種持續增加，38 d時增加到24 種；4）細菌群落結構變化和相關性分析表明，鮮印度塊菌在冷藏過程中的絕對優勢菌門為Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Firmicutes和Verrucomicrobia。基于屬水平的RDA結果表明，在A階段，營養組分（總糖、總蛋白和粗纖維）和特征性揮發芳香物質（1-辛烯-3-醇、正戊酸正戊酯、乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-辛酮、1-辛烯-3-酮、己醛以及正己醇）含量變化與Bradyrhizobium、Rhizobium、Bosea、Variovorax、Dyadobacter、Janthinobacterium以及Pedobacter相對豐度呈正相關，其中總蛋白、1-辛烯-3-醇、正戊酸正戊酯含量與Bosea相對豐度呈正相關，Pseudomonas和Serratia相對豐度同質量損失率在25 d后呈正相關；在冷藏的30～38 d，吡啶、二甲醚、3-甲基丁酸、己酸、庚醛、巴豆醇、3-甲硫基丙醇以及3-甲基-1-丁醇含量同Ensifer、Pseudomonas、Serratia相對豐度呈正相關。綜合分析表明鮮印度塊菌營養組分、揮發性芳香物質和異味物質在冷藏期間的不同階段發生變化，這種變化與特定的細菌群落密切相關。該結果可為進一步深入研究鮮印度塊菌腐敗機制和貯藏保鮮新技術提供參考。