柴坤解郁湯對圍絕經期抑郁大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸激素及下丘腦雌激素受體α表達的影響

李夢媛，李小黎，薛 冰，張乃文，魯麗華，張 婧，刁華瓊，陳 琳

(1.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029；2.首都醫科大學，北京 100029)

女性在中年期由于體內雌激素水平減少導致機體出現一系列以軀體、精神癥狀為主的圍絕經期表現，平素工作壓力大、社會家庭關系不和諧等因素的刺激，更易導致女性圍絕經期抑郁癥的發生[1]。該病以情緒低落、焦慮憂郁等癥狀為主，伴有潮熱盜汗、煩躁不安、記憶力下降等表現。研究[2]顯示，圍絕經期抑郁女性在心理健康、生活質量方面比同期女性更差。研究[3-6]表明，雌激素撤退可導致海馬神經細胞再生障礙，下丘腦-垂體-卵巢(hypothalamus-pituitary-ovary,HPO)軸、下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal, HPA)軸功能異常和單胺類神經遞質缺乏，從而引起圍絕經期抑郁的發生。臨床多采用激素及抗抑郁類藥物治療[7]，雖見效快，但存在不良反應大、復發率高等問題，而中醫辨證論治對該病的治療有獨特的優勢[8]。柴坤解郁湯是治療圍絕經期抑郁的臨床經驗方。本研究從去勢應激模型大鼠行為學變化、HPO軸激素水平變化以及下丘腦雌激素受體α(estrogen receptor alpha,ERα)水平變化方面，探究柴坤解郁湯改善圍絕經期抑郁的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康雌性SD大鼠，體質量(190±20)g，共60只。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物生產許可證號為SCXK(京)2012-0001]，飼養于首都醫科大學動物實驗室。本實驗經首都醫科大學動物倫理委員會批準，倫理審查編號為AEEI-2021-218。

1.2 藥物及試劑 柴坤解郁湯(益母草24 g,刺五加、烏梅、浮小麥各18 g,合歡花、巴戟天各12 g,柴胡、郁金、梔子各9 g)，購自北京中醫藥大學第三附屬醫院，并制成顆粒劑；鹽酸氟西汀膠囊(H20073985)：山西仟源醫藥集團股份有限公司；大鼠卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)/黃體生成素(luteinizing hormone，LH)/雌二醇(estradiol,E2)酶聯免疫吸附試驗試劑盒(E-EL-R0391c/E-EL-R0026c/E-EL-0152c)：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；抗雌激素受體α(estrogen receptor alpha,ERα)抗體(1325)：美國細胞信號技術公司；抗GAPDH抗體(ab9485)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(ab7090)：英國艾博抗；Tris-glycine-SDS電泳緩沖液(AR0139)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(AR0138)、Trizol試劑(FTR-50)：北京賽百盛；反轉錄試劑盒(QP056)：GeneCopeia；2×SYBR Green qPCR反應混合液(無ROX)(MPC2107026)：武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器 5415D型離心機：德國Eppendorf公司；酶標分析儀：北京普朗新技術有限公司；LabWorksTM凝膠成像及分析系統：美國UVP公司；iQ5 Real-time PCR擴增儀：美國Applied Biosystems公司；曠場試驗敞箱及數據分析、強迫游泳試驗裝置：首都醫科大學行為學平臺實驗室。

2 方法

2.1 圍絕經期抑郁大鼠模型復制、分組及給藥 將SD大鼠適應性喂養1周后，將其隨機分為假手術組，模型組，柴坤解郁湯低、中、高劑量組和鹽酸氟西汀組，每組10只。參照文獻[9-10]的方法及本實驗室前期預實驗結果，采用去勢手術聯合慢性不可預知性溫和刺激(chronic unpredictable mild stimulation,CUMS)兩步法復制圍絕經期抑郁模型。①去勢手術。用1.5%戊巴比妥鈉5 mL/kg對大鼠進行麻醉，在背部肋弓下1 cm與脊柱側面1 cm相交處，剪開切口，用鑷子找出一團被脂肪組織包裹的粉紅色菜花狀卵巢，在近子宮角位置進行結扎，切除雙側卵巢。假手術組僅切除卵巢周圍少量脂肪,術后無需特殊護理。②CUMS。術后第8天，對摘除卵巢的模型組大鼠開始進行CUMS處理，假手術組正常飼養。每天隨機給予2種不同刺激，持續21 d。同種刺激再次出現的間隔周期為4 d以上。刺激方法：鼠籠傾斜24 h(將鼠籠傾斜至45°)；擁擠鼠籠24 h；持續光照24 h；禁食24 h；禁水24 h；4 ℃冷水中5 min；單籠飼養24 h；束縛(束縛盒束縛四肢限制活動)3 h；潮濕墊料24 h；夾尾3 min。以糖水偏愛率降低、強迫游泳不動時間增加等指標[11-12]判斷模型是否復制成功。參照課題組前期實驗有效藥量[13]，按照成人用量7倍計算大鼠灌胃量，柴坤解郁湯低、中、高劑量組給藥劑量分別為0.9、1.8、3.6 g/kg，分別相當于成人臨床用量的3.5、7、14倍，以10 mL/kg生理鹽水配置顆粒劑，3組濃度分別為0.11、0.22、0.44 g/mL，鹽酸氟西汀組給藥劑量為2.33 mg/kg，灌胃濃度為0.70 g/mL。假手術組和模型組予以等容積生理鹽水。以上灌胃均每日1次，從應激開始到實驗結束，持續21 d。

2.2 行為學觀察

2.2.1 蔗糖水偏好試驗 蔗糖水偏好試驗主要測試大鼠快感是否缺失，而快感缺失是衡量抑郁癥狀的重要標準。模型復制第21天，12 h禁食禁水后，將大鼠單籠放置，給每個籠子兩瓶同樣容積的液體(一瓶為1%蔗糖水，一瓶為純水)，4 h后取走兩個瓶子并稱質量。大鼠蔗糖水偏愛率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

2.2.2 曠場試驗 模型復制第21天，將大鼠放入100 cm×100 cm×40 cm的曠場反應箱內底面正中心，進行攝像和計時，觀察并記錄每只大鼠在5 min內所有活動距離及進入中心區域的活動距離。實驗時保持安靜，采用Super Maze視頻記錄分析軟件(上海欣軟信息科技有限公司)記錄曠場試驗結果。

2.2.3 強迫游泳試驗 模型復制第21天，在室溫下將大鼠置入水深約37 cm的溫水中，強迫大鼠游泳6 min，記錄后4 min 內大鼠靜止不動時間，表現為大鼠僅有頭部露出水面，身體呈現飄浮狀態，四肢可有微動但不掙扎。

2.3 ELISA法檢測大鼠血清FSH、LH、E2水平 從大鼠腹主動脈取血，靜置30 min后，3 500 r/min離心10 min，分離血清，放置于-80 ℃冰箱中保存，采用ELISA試劑盒測定血清FSH、LH、E2水平。

2.4 Western blot法檢測大鼠下丘腦ERα蛋白表達水平 取大鼠下丘腦組織，提取總蛋白，蛋白定量后配制SDS-PAGE凝膠，于4 ℃轉膜緩沖液中350 mA恒電流轉膜2 h，將膜按蛋白的印跡位置剪開，置于含ERα一抗(1∶1 000)的Blotto中，搖動漂洗后，放入對應二抗(1∶8 000)的Blotto中，將膜置于曝光盒中，對感光膠片進行曝光后進行顯影、定影處理，分析各組蛋白條帶的亮度值。

2.5 Rt-PCR法檢測大鼠下丘腦ERα mRNA表達水平 將上述-80 ℃冰箱中儲存的腦組織，加入1 mL Trizol研磨，按說明書步驟提取RNA，加入20 μL DEPC水溶解混勻，分別留取1 μL用于定量和電泳，其余RNA置-80 ℃保存。按照反轉錄反應說明書將RNA反轉錄，得到cDNA。每個反轉錄產物均在PCR儀上進行擴增。ERα正向引物：5′-CATTATGGGGTCTGGTCCTGCG-3′；ERα反向引物：5′-GCCCACTTCGTAACACTTGC-3′。GAPDH正向引物：5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3′；GAPDH反向引物：5′-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′。循環溫度和時間：95 ℃，30 s；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s。共40個循環。最后進行數據處理分析。

3 結果

3.1 6組大鼠蔗糖水偏好率、曠場試驗結果、強迫游泳不動時間比較 與假手術組比較，模型組大鼠蔗糖水偏好率、曠場總路程、曠場中心區域路程顯著降低(P<0.05)，強迫游泳不動時間顯著延長(P<0.05)。與模型組比較，柴坤解郁湯中、高劑量組及鹽酸氟西汀組蔗糖水偏好率，曠場總路程、曠場中心區域路程顯著升高(P<0.05)，柴坤解郁湯高劑量組、鹽酸氟西汀組強迫游泳不動時間顯著縮短(P<0.05)。柴坤解郁湯中、高劑量組和鹽酸氟西汀組蔗糖水偏好率、曠場總路程和曠場中心區域路程顯著大于柴坤解郁湯低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 6組大鼠蔗糖水偏好率、曠場試驗結果、強迫游泳不動時間比較

3.2 6組大鼠血清FSH、LH、E2水平及下丘腦ERα蛋白和mRNA表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清FSH、LH水平顯著升高(P<0.05)，血清E2水平及下丘腦ERα蛋白和ERα mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，柴坤解郁湯中、高劑量組與鹽酸氟西汀組FSH、LH水平顯著降低(P<0.05)，E2水平及下丘腦ERα蛋白和其mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。柴坤解郁湯中、高劑量組和鹽酸氟西汀組血清FSH、LH水平顯著低于柴坤解郁湯低劑量組(P<0.05)，血清E2水平和下丘腦ERα表達水平顯著高于柴坤解郁湯低劑量組(P<0.05)；柴坤解郁湯中劑量組E2水平顯著高于鹽酸氟西汀組(P<0.05)。見表2和圖1。

表2 6組大鼠血清FSH、LH、E2含量及下丘腦ERα蛋白和mRNA表達水平比較

注：A.假手術組；B.模型組；C.柴坤解郁湯低劑量組；D.柴坤解郁湯中劑量組；E.柴坤解郁湯高劑量組；F.鹽酸氟西汀組

4 討論

相關調查[14]顯示，在世界范圍內圍絕經期抑郁發病率約為25%，這一疾病已經嚴重影響中年女性的生活質量。目前，抑郁癥動物模型主要有脂多糖腹腔注射模型、嗅球摘除模型、基因模型、CUMS模型等[15]。考慮到模型穩定性及實驗可操作性，本研究采用CUMS聯合去勢手術復制圍絕經期抑郁動物模型。

圍絕經期抑郁屬于中醫學“絕經前后諸癥”“郁證”等范疇，其發生與肝腎兩臟功能失調密不可分。女子“七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子”(《素問·上古天真論》)。圍絕經期婦女天癸漸竭，腎氣漸衰，精血不足，沖任空虛，再加上女性平素易受七情所傷，常憂思多慮，致肝氣失疏，氣機郁結不暢，從而易發展為本病。《景岳全書》：“情志之郁，總由乎心，此因郁而病也。”因此，圍絕經期抑郁的基本病機為腎虛肝郁[16]。柴坤解郁湯是臨床經驗方，對腎虛肝郁型圍絕經期抑郁的療效顯著。本方以柴胡和刺五加為君，活血祛瘀、補腎益氣、安神益智；臣藥益母草活血散瘀調經，為婦科圣藥；佐以浮小麥、烏梅養心安神、清虛熱、斂陰止汗，合歡花安神解郁、養血寧心，郁金既能活血也能行氣，有涼血清心、解郁行氣之功，巴戟天補腎益精，配以少量梔子以清氣分郁熱、涼血除煩。全方標本兼治，配伍合理，共奏補益腎精、疏肝解郁、養心安神之功。

行為學試驗結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠蔗糖水偏好率、曠場總路程、曠場中心區域路程均顯著降低，強迫游泳不動時間明顯增加，表明模型組大鼠對新異環境的探索行為和自主行為減少，對美好事物的欣快感降低，遇到危險的絕望度增加，說明圍絕經期抑郁模型大鼠處于應激狀態。與模型組大鼠比較，柴坤解郁湯中、高劑量組大鼠蔗糖水偏好率、曠場總路程、曠場中心區域路程均顯著升高，提示柴坤解郁湯能夠有效改善圍絕經期抑郁大鼠應激狀態。

研究[17]表明，圍絕經期系列癥狀主要是由卵巢功能退行性改變，機體雌激素水平明顯波動或下降，導致HPO軸失衡引起的。HPO軸是調節女性生理現象的神經-內分泌系統，主要是由下丘腦弓狀核和室旁核脈沖式分泌促性腺激素釋放激素，再通過門脈系統的微血管傳遞至垂體前葉，刺激垂體釋放FSH和LH，LH和FSH再促進卵巢分泌E2[18]。臨床研究[19]表明，圍絕經期抑郁患者血清E2水平低于圍絕經期無癥狀者，但FSH、LH等激素水平顯著升高，說明HPO軸激素水平波動與圍絕經期抑郁的發病密切相關。本研究結果顯示，模型組E2水平顯著低于假手術組，而FSH、LH水平明顯高于假手術組；治療后柴坤解郁湯中、高劑量組E2水平明顯升高，FSH、LH水平明顯降低，且柴坤解郁湯中劑量組E2水平顯著高于柴坤解郁湯高劑量組和鹽酸氟西汀組，說明柴坤解郁湯可能通過提高E2水平影響HPO軸激素水平變化，從而發揮改善圍絕經期抑郁的作用。非孕婦女體內雌激素除了卵巢合成分泌之外，還可以通過腎上腺皮質及周圍脂肪組織、肝臟等芳香化途徑轉化而成。鹽酸氟西汀干預后模型大鼠血清E2水平的恢復可能是其對腎上腺皮質的激發作用所致[20]。

雌激素通過與雌激素受體結合發揮抗抑郁作用，主要通過ERα和ERβ這兩種ER亞型作用于細胞。研究[21]表明，ER激動劑可發揮抗抑郁樣作用，反之，雌激素受體拮抗劑則會阻斷雌激素的抗抑郁作用。圍絕經期不僅雌激素水平下降明顯，神經系統、免疫組織或心腦血管系統中雌激素受體表達水平也發生變化[22]。ERα在下丘腦、垂體細胞及免疫細胞的生長、存活和應答中起到關鍵作用，是介導雌激素信號轉導通路的重要蛋白。研究[23]發現，大約40%的ERα結構與下丘腦室旁核釋放的促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)相似，并且發現雌激素反應元件存在于CRH啟動子區，說明雌激素可能通過ERα及CRH神經細胞共區域化直接影響CRH水平，進而影響HPA軸，導致抑郁發生。下丘腦作為神經內分泌調節的中樞系統，是維持機體內環境穩定的重要部分。本研究結果表明，與假手術組比較，模型組大鼠下丘腦ERα表達水平顯著下降；與模型組比較，柴坤解郁湯中、高劑量組和鹽酸氟西汀組下丘腦ERα表達水平顯著升高；柴坤解郁湯中、高劑量組下丘腦ERα表達水平較接近于假手術組。結果表明，柴坤解郁湯可增加模型大鼠下丘腦ERα的表達水平，可能是該方通過提高體內雌激素水平，影響HPO軸激素變化，從而提高下丘腦ERα水平，以此增強雌激素的生物學效應。

綜上所述，柴坤解郁湯可以有效預防并改善圍絕經期抑郁大鼠的應激狀態，其作用機制與其影響HPO軸激素水平以及調節下丘腦ERα表達水平有關。