當歸補血湯調節自噬干預心肌梗死模型大鼠心肌損傷的作用機制

陳 前，申楚翹，程 凱，袁慧倫，葉 樹，申國明，江愛娟

(1.安徽中醫藥大學中西醫結合學院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，安徽 合肥 230031)

心肌梗死是因暫時或永久性冠狀動脈閉塞，導致負性心肌重構、收縮功能障礙、心肌壞死、心律失常，甚至心力衰竭的一種嚴重的心血管疾病[1]。心肌梗死的發病機制復雜，包括氧化應激、鈣超載、線粒體紊亂、細胞自噬、炎癥反應等。

自噬是普遍存在于真核生物細胞中的一種生理現象，在高血壓病、心力衰竭、心肌梗死等疾病的發病方面起著非常重要的作用[2]。研究[3]表明，自噬通過降解錯誤折疊蛋白、減輕線粒體功能障礙和抑制氧化應激維持心臟功能并減少心肌損傷。因此，自噬對心臟穩態和功能至關重要。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路是介導自噬的經典信號通路，有研究[4]表明，其與心血管疾病的病理進程有密切關系。自噬功能的增強有利于心肌梗死的治療[5]。促進心肌梗死中自噬的發生是緩解心肌細胞死亡和保護心功能的一種有效方法。

當歸補血湯由黃芪、當歸兩味中藥組成，功能益氣補血、活血化瘀，用于治療心血管疾病[6]。有研究[7]發現，當歸補血湯可以通過抑制心肌細胞凋亡改善心臟病理學改變。且當歸補血湯預處理還可以通過增加心肌細胞對氧化應激損傷的抵抗力，提供更有效的心臟保護[8]。還有研究[9]發現，當歸補血湯通過促進線粒體自噬改善線粒體功能，抑制心肌細胞凋亡從而改善慢性間歇性低氧小鼠心功能。這些研究結果表明，當歸補血湯可以調節受損心肌的自噬，起到保護心臟的作用，但是其機制尚不明確。本實驗通過觀察當歸補血湯預給藥對冠狀動脈左前降支結扎致心肌梗死大鼠心肌損傷、病理改變和PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響，探究其調節自噬改善心肌梗死大鼠心肌損傷的作用機制，為臨床防治心肌梗死提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 50只SPF級SD大鼠，體質量180～220 g，雄性，購自江蘇省邳州市東方養殖有限公司[生產許可證號：SCXK(蘇)2017-003]，實驗室飼養溫度為(23±2)℃，濕度為40%～70%。

1.3 試劑 TTC粉(貨號 T8170)：北京索萊寶科技有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(貨號 A020-2)：南京建成生物工程研究所；肌酸激酶心肌型同工酶(creatine kinase-myocardial band，CK-MB)試劑盒(貨號 JL12296)：上海江萊生物科技有限公司；磷酸化PI3K(phosphorylate PI3K,p-PI3K)兔抗大鼠抗體(批號 BS4605)：美國Bioworld公司；磷酸化AKT(phosphorylate AKT,p-AKT)兔抗大鼠抗體(批號 4060S)、磷酸化mTOR(phosphorylate mTOR, p-mTOR)兔抗大鼠抗體(批號 5536S)、LC3A/B兔抗大鼠抗體(批號 4108S)、Beclin-1兔抗大鼠抗體(批號 3495T)、p62兔抗大鼠抗體(批號 39749T)：美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH(批號 TA-08)：北京中杉金橋生物技術有限公司；ECL超敏發光試劑盒(貨號 BL520B)：中國Biosharp公司。

1.4 儀器 病理切片機(RM2016)：上海徠卡儀器有限公司；光學顯微鏡(Eclipse E100)：日本尼康公司；電泳儀(EPS300)：上海天能科技有限公司；凝膠成像系統(JS-M6P)：上海培清科技有限公司。

2 方法

2.2 動物取材 復制模型24 h后，用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，從腹主動脈取血，隨后取出大鼠心臟，清洗并剔除非心肌組織后用濾紙吸干水分。每組隨機挑選3只大鼠心臟做TTC染色，取每組剩余大鼠心臟結扎部位以下部分組織，置于4%多聚甲醛中固定；取大鼠左心室梗死區組織，置于-80 ℃冰箱備用。

2.3 心肌梗死面積檢測 取剔除非心肌組織后的心肌組織，自冠狀面切成4～5片2～3 mm厚的切片，放入37 ℃預溫的2% TTC染液中，染色10～15 min后取出，白色代表梗死組織。采用Image J(1.51J8)分析梗死面積。以白色梗死面積與全切片面積的百分比作為梗死面積。

2.4 心臟的組織形態觀察 取出用4%多聚甲醛固定的心臟，常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光學顯微鏡下觀察心臟的組織形態。

2.5 血清LDH和CK-MB檢測 從腹主動脈取血，2 500 r/min離心10 min，取上清液，用生化試劑盒檢測血清LDH水平，用ELISA試劑盒檢測血清CK-MB水平。

2.6 Western blot檢測心肌組織PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及自噬相關蛋白表達水平 從-80 ℃冰箱中取出大鼠心臟，選取左心室梗死區心臟組織用于提取總蛋白，用BCA對組織蛋白定量后，加入蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴加熱5～10 min后，于SDS-PAGE凝膠中進行電泳并轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，用TBST洗10 min，共3次，分別與p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin-1的一抗(1∶1 000)孵育，4 ℃過夜，次日從一抗中拿出條帶，用TBST洗10 min，共3次，然后放入對應的二抗，室溫孵育1.5～2 h。TBST洗10 min，共3次，再加入ECL發光試劑顯影、定影。以目標蛋白灰度值與內參的灰度值比值作為蛋白的相對表達水平。

3 結果

注：A.假手術組；B.模型組；C.當歸補血湯低劑量組；D.當歸補血湯高劑量組；E.地爾硫組

表1 5組大鼠心肌梗死面積比較

注:A.假手術組;B.模型組;C.當歸補血湯低劑量組;D.當歸補血湯高劑量組;E.地爾硫組

表2 5組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較

注：A.假手術組；B.模型組；C.當歸補血湯低劑量組；D.當歸補血湯高劑量組；E.地爾硫組；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與當歸補血湯低劑量組比較，△P<0.05

注：A.假手術組；B.模型組；C.當歸補血湯低劑量組；D.當歸補血湯高劑量組；E.地爾硫組；與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與當歸補血湯低劑量組比較，△P<0.05

4 討論

心肌梗死屬于中醫學“真心痛”“胸痹”等病范疇，其主要病機為氣血陰陽不足，邪閉心脈，不通則痛[10]。《難經·十四難》云：“損其肺者，益其氣；損其心者，調其榮衛；損其脾者，調其飲食。”故治療胸痹心痛當調其氣血。當歸補血湯出自李東垣《內外傷辨惑論》，方中黃芪大補肺脾之氣，以滋生化之源；當歸養血和營，兩者合用，氣血雙補。本實驗中，模型組大鼠出現明顯心肌梗死，心肌細胞破裂、心肌纖維排列紊亂、大量炎癥細胞浸潤，且血清CK-MB和LDH水平明顯升高，提示模型復制成功。當歸補血湯干預后，大鼠心肌梗死面積縮小，心肌損傷程度減輕，血清CK-MB和LDH水平降低，提示當歸補血湯有明顯改善大鼠心肌梗死的作用。

自噬是一個高度保守的自我降解過程，參與心血管疾病等多種疾病，與心肌梗死的發生密切相關。有研究[11]發現，發生心肌梗死時，線粒體中自噬小體受損，心肌細胞大量凋亡，而適當促進自噬能清除凋亡的細胞以保護受損的心臟。據報道[12]，Beclin-1可促進脂質膜延伸、物質募集和自噬體成熟，是心臟中關鍵的自噬調節器。Beclin-1、LC3、p62蛋白參與自噬小體的形成與自噬溶酶體降解的過程，也因此成為經典的自噬標志物。自噬小體的減少會導致Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表達水平降低[13]，而p62蛋白由于細胞無法正常形成自噬溶酶體并進行降解而表達水平升高[14]。本研究結果顯示，心肌梗死后Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平降低，而p62表達水平升高。這些結果表明，心肌梗死后自噬功能顯著受損。相反，當歸補血湯可逆轉心肌梗死誘導的這些自噬相關蛋白表達水平的紊亂，表明當歸補血湯可以激活自噬以發揮其心臟保護作用。

增強的心肌細胞自噬可由PI3K/AKT/mTOR信號通路介導[15]，PI3K可以在自身磷酸化后活化，將磷脂酰肌醇磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol triphosphate，PIP3)。PIP3結合3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1進行磷酸化，激活下游分子AKT，而磷酸化AKT的產生會激活雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)。當mTORC1水平上升時，mTORC1通過對Unc-51自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)進行抑制性磷酸化，導致無法啟動自噬小體的形成過程[16-17]。本研究結果顯示，模型組p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平明顯升高，表明發生心肌梗死時PI3K/AKT/mTOR信號通路被激活，導致自噬的形成過程受到抑制，而當歸補血湯能明顯降低p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表達水平。結果表明，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活，在一定程度上促進自噬從而達到保護受損心肌的作用。

綜上所述，當歸補血湯可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路促進自噬的形成，激活細胞自噬，從而保護心肌梗死引起的心肌損傷，但其具體機制尚需進一步研究。