lncRNA ATP6V1B1-AS1對非小細胞肺癌增殖與侵襲的作用及其機制

李依霖，葉軍，何連棟，王嘉俊，許順

（中國醫科大學附屬第一醫院胸外科，沈陽 110001）

肺癌是目前全球范圍內第二高發的癌癥［1］。我國肺癌的發生率和死亡率均排在惡性腫瘤的首位［2］。因此，明確肺癌發生發展的機制意義重大。

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是不編碼蛋白質的RNA，在多種腫瘤的發生發展的調控中起著至關重要的作用［3-5］。ncRNA根據結構可分為環狀RNA和線性RNA，其中線性RNA根據長度可分為微RNA（microRNA，miRNA）和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）［6］。lncRNA是超過200個核苷酸的ncRNA，可通過組蛋白修飾、染色質重塑、與轉錄因子的相互作用以及DNA甲基化等方式調控基因活性［7］。大量研究［8-11］表明，lncRNA在多種腫瘤中廣泛表達，其異常表達與非小細胞肺癌的增殖、遷移、侵襲等密切相關，但其作用機制尚未明確。在與腫瘤相關的lncRNA中，關于ATP6V1B1-AS1的研究尚未見報道。

本研究通過體外實驗探討ATP6V1B1-AS1在非小細胞肺癌細胞中的表達及其對于非小細胞肺癌增殖和侵襲的影響；并利用生物信息學分析其作用機制，旨在為非小細胞肺癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及處理

非小細胞肺癌細胞系（A549、SK-MES-1、1299、H460）及正常人支氣管上皮細胞系（16-HBE）購自中科院細胞庫。10%胎牛血清（美國CLARK Bioscience公司）配置的1640培養基（以色列Biological Industries公司）、MEM培養基（美國Hyclone公司）37 ℃，5%CO2以及飽和濕度中培養。

1.2 總RNA提取及實時定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測

非小細胞肺癌細胞系及正常人支氣管上皮細胞系總 RNA 均使用 Trizol 試劑提取。使用 Prime Script?RT reagent Kit 反轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司）反轉錄和細胞的總 RNA后，使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑（日本TaKaRa公司）QuantStudio 1 Real-time PCR 儀用進行qRT-PCR檢測。主要引物：ATP6V1B1-AS1，正向引物，5’-TCATTTTCATGAATG CTGCCTCT-3’；反向引物，5’-CTGTGCAAGAATCAC CGTGC-3’；GAPDH，正向引物，5’-CGGATTTGGTC GTATTGGG-3’；反向引物，5’-CTGGAAGATGGTGA TGGGATT-3’，使用2-ΔΔCt法進行計算。

1.3 ATP6V1B1-AS1泛癌差異表達分析

從UCSC Xena數據庫（https：//xenabrowser.net/）下載癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）泛癌數據集，數據集包含22種癌型，10 533個（癌9 806個；正常727個）樣本。使用文件注釋后，僅保留ATP6V1B1-AS1的表達數據，使用R包“ggpubr”繪制ATP6V1B1-AS1在每個癌型中的表達情況，組間使用Wilcox計算顯著性。

1.4 細胞siRNA轉染及穩定表達細胞系構建

A549細胞中加入ATP6V1B1-AS1 過表達病毒懸液及病毒轉染增強劑（5 μg/mL），使用抗稻瘟霉素篩選穩定轉染細胞；在SK-MES-1中加入siRNA及Lipo8000，48 h后換液用作后續實驗。

1.5 CCK8實驗檢測細胞增殖能力

轉染后細胞按照6×103/孔接種于96孔板，于0、24、48、72、96 h加入CCK8試劑37 ℃孵育2 h，然后測定450 nm波長的吸光度（optical density，OD）值，并繪制細胞增殖曲線。

1.6 細胞侵襲能力檢測

1.6.1 Transwell實驗：向Transwell小室上室中加入200 μL、約6×104個細胞的細胞雙無懸液，下室中加入600 μL由15%胎牛血清配置的培養基。水平置于孵箱中培養 48 h，固定后制片，觀察細胞侵襲數量，隨機視野獨立取圖5次。

1.6.2 Western blotting檢測相關蛋白表達：選取狀態良好的過表達及敲減細胞，提取全蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度，隨后進行SDS-PAGE電泳，轉膜封閉后，4 ℃一抗封閉過夜，二抗封閉1 h，ECL發光顯影測定E-cadherin、MMP9、Snail及GAPDH蛋白表達。

1.7 內源競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）網絡的構建

從UCSC Xena數據庫下載TCGA-LUAD的miRNA數據集［log2（FPKM+1）］，包含564個（其中癌518個，正常46個）樣本，使用R包對轉換探針名稱后的表達譜進行差異分析，設置差異表達基因的篩選閾值（|log2FC|＞0.001，P＜ 0.05），另外ATP6V1B1-AS1分別在Starbase（https：//starbase.sysu.edu.cn/）、lncRNASNP2（https：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP/）數據庫中預測下游miRNA，兩者結果取并集，得到的miRNA與前下調的miRNA取交集。取得交集的miRNA在miRwalk（https：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、miRdb（https：//mirdb.org/）數據庫中預測mRNA；另外從UCSCxena數據庫下載TCGA-LUAD的mRNA數據集［log2（FPKM+1）］，包含585個（其中癌526個，正常59個）樣本。使用R包 “tinyarray”對數據集的ENSEMBL_ID進行轉換；使用R包“limma”對轉換后的表達譜進行差異分析，設置差異mRNA的篩選閾值（|log2FC|＞1，P＜ 0.05），將篩選出的mRNA與表達上調的mRNA取交集，構建ceRNA網絡并繪制火山圖。

1.8 基因本體（Gene Ontology，GO）數據庫及京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析

將ceRNA網絡中20個mRNA進行GO及KEGG功能富集分析，過濾閾值P＜ 0.05，預測ATP6V1B1-AS1可能參與調控網絡的生物學功能。

2 結果

2.1 ATP6V1B1-AS1在22個癌種中表達量的泛癌分析及其在非小細胞肺癌細胞系中的表達水平

結果顯示，ATP6V1B1-AS1在多種癌癥中高表達，并且肺鱗癌及肺腺癌中高表達，差異具有統計學意義（P＜ 0.05），見圖1。Starbase數據庫中ATP6V1B1-AS1在非小細胞肺癌中的表達結果顯示，肺鱗癌及肺腺癌中ATP6V1B1-AS1高表達（圖2），與泛癌分析中ATP6V1B1-AS1表達情況一致。qRT-PCR檢測結果顯示，與正常對照組比較，非小細胞肺癌細胞系A549、H460、H1299、SK-MES-1中ATP6V1B1-AS1的表達均顯著增高（均P＜ 0.05），見圖3。

圖1 ATP6V1B1-AS1表達的泛癌分析結果Fig.1 Pancancer analysis of ATP6V1B1-AS1 expression

圖2 Starbase數據庫中在肺腺癌及肺鱗癌中ATP6V1B1-AS1的表達Fig.2 Expression of ATP6V1B1-AS1 in lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma in the Starbase database

圖3 ATP6V1B1-AS1在非小細胞肺癌細胞系（A549、H460、H1299、SK-MES-1）中的表達Fig.3 Expression of ATP6V1B1-AS1 in non-small cell lung cancer cell lines（A549，H460，H1299，SK-MES-1）

2.2 構建過表達、敲減ATP6V1B1-AS1非小細胞肺癌細胞系

根據4種非小細胞肺癌細胞中ATP6V1B1-AS1的相對表達量，使用siRNA對相對表達量最高的SKMES-1細胞進行ATP6V1B1-AS1敲減；使用慢病毒對相對表達量最低的A549細胞進行ATP6V1B1-AS1過表達，最終分別測定兩個處理組的轉染效率，結果顯示，A549細胞中ATP6V1B1-AS1明顯過表達；SKMES-1細胞中ATP6V1B1-AS1表達明顯減少，與對照組比較，si2組、si3組si-ATP6V1B1-AS1的敲減效率差異有統計學意義（均P＜ 0.05），因此將這2種非小細胞肺癌細胞系用于后續實驗。見圖4。

圖4 qRT-PCR檢測A549細胞中過表達ATP6V1B1-AS1和 SK-MES-1細胞中敲減ATP6V1B1-AS1后ATP6V1B1-AS1相對表達水平Fig.4 The relative expression of ATP6V1B1-AS1 after transfection with over expression ATP6V1B1-AS1 in the A549 cell line and after transfection with si-ATP6V1B1-AS1 in the SK-MES-1 cell line was determined by qRT-PCR

2.3 細胞增殖能力檢測

敲減及過表達ATP6V1B1-AS1細胞后測定細胞增殖能力。結果顯示，敲減ATP6V1B1-AS1非小細胞肺癌細胞增殖能力減弱（P＜ 0.05），過表達ATP6V1B1-AS1非小細胞肺癌細胞增殖能力增強（P＜0.05）。見圖5。

圖5 敲減和過表達ATP6V1B1-AS1后非小細胞肺癌細胞的增殖能力Fig.5 The proliferation ability of non-small cell lung cancer cells after ATP6V1B1-AS1 knockdown and overexpression

2.4 細胞侵襲能力檢測

過表達及敲減ATP6V1B1-AS1細胞系后選取狀態良好的細胞，進行細胞侵襲能力測定；采用Western blotting檢測過表達及敲減ATP6V1B1-AS1后A549 細胞和SK-MES-1細胞侵襲相關蛋白表達水平的變化。結果顯示，A549細胞過表達ATP6V1B1-AS1后侵襲能力增強，SK-MES-1細胞敲減ATP6V1B1-AS1后侵襲能力減弱。見圖6。與對照組比較，過表達ATP6V1B1-AS1后A549細胞E-cadherin蛋白表達減少，Snail和MMP9蛋白表達增加（均P＜0.05）；敲減ATP6V1B1-AS1后SK-MES-1細胞的E-cadherin蛋白表達增加，Snail和MMP9蛋白表達減少（均P＜ 0.05）。見圖7。

圖7 過表達、敲減ATP6V1B1-AS1后非小細胞肺癌細胞侵襲相關蛋白表達Fig.7 Invasion-related protein expression in non-small cell lung cancer cells following ATP6V1B1-AS1 overexpression and knockdown

2.5 ATP6V1B1-AS1參與的ceRNA網絡構建及GO、KEGG功能富集分析

TCGA數據庫中miRNA和mRNA差異表達分析結果顯示，獲得513個miRNA，其中差異表達上調381個，差異表達下調132個，見圖8。獲得 1 702個mRNA，其中差異表達上調713個，差異表達下調989個，見圖9。

圖9 mRNA TCGA_LUAD差異表達基因的火山圖Fig.9 Volcanic figure of mRNA TCGA_LUAD differential expression gene

將ATP6V1B1-AS1在Starbase、lncRNAS-NP2數據庫中預測miRNA，lncRNASNP2數據庫中有107對lncRNA-miRNA關系對，Starbase數據庫中有22對lncRNA-miRNA關系對，兩者取并集，預測結果與396個差異miRNA取交集，得到5個miRNA，其中4個可預測到下游mRNA。將上述獲得交集的miRNA在miRwalk、miRdb數據庫中預測mRNA，miRdb數據庫中有4 101個miRNA-mRNA關系對，miRwalk數據庫中有12 250個miRNA-mRNA關系對，二者取交集，共獲得936對miRNA-mRNA，將mRNA與差異表達上調的mRNA取交集，得到20個mRNA。將上述獲得的4個miRNA及20個mRNA與ATP6V1B1-AS1構建lncRNAmiRNA-mRNA的關系對，繪制網絡調控圖，結果顯示，miR-520a-5p、miR-526b-3p、miR-4524a-3p、miR-6730-5p可能作為ATP6V1B1-AS1的下游基因，并且可以調控WNT3、PAICS等基因發揮ATP6V1B1-AS1促進非小細胞肺癌增殖、侵襲的作用。見圖10。

圖10 ceRNA網絡調控圖Fig.10 ceRNA network

GO功能富集分析結果顯示，ATP6V1B1-AS1下游mRNA與腺體發展等功能有關，KEGG功能富集分析顯示ATP6V1B1-AS1與嘌呤代謝等功能相關。見圖11、12。

圖11 GO功能富集分析Fig.11 GO functional enrichment analysis

圖12 KEGG功能富集分析Fig.12 KEGG functional enrichment analysis

3 討論

lncRNA的異常表達在多種腫瘤中都起到了促進腫瘤發生、發展的作用［12-13］。MALAT-1、H19等多種lncRNA都與非小細胞肺癌的發生發展有密切聯系。本研究中的ATP6V1B1-AS1位于 2p13.3，與編碼基因ATP6V1B1的轉錄方向相反。已有研究［14-15］表明ATP6V1B1可以通過影響能量代謝等過程影響機體內免疫細胞的殺傷、酸堿代謝等多種生物學行為。

本研究泛癌表達分析結果顯示，惡性腫瘤中ATP6V1B1-AS1可能存在異常表達，并且在肺腺癌、肺鱗癌中可能存在表達差異。qRT-PCR檢測結果顯示非小細胞肺癌細胞系中ATP6V1B1-AS1相對表達量高于正常人支氣管上皮細胞（P＜ 0.05）。體外實驗結果顯示，過表達ATP6V1B1-AS1后能夠促進非小細胞肺癌的增殖和侵襲。本研究通過生物信息學方法，構建了ATP6V1B1-AS1可能參與調控的ceRNA網絡，預測了ATP6V1B1-AS1下游結合的miRNA-mRNA對。GO及KEGG功能富集分析結果表明，ATP6V1B1-AS1可能通過下游的ceRNA網絡參與調控嘌呤代謝、腺體發展等多種生物學功能。

綜上所述，ATP6V1B1-AS1在非小細胞肺癌中高表達，并且可以促進非小細胞肺癌的增殖、侵襲，通過ceRNA網絡調控下游基因，從而影響相應生物學功能。本研究為明確ATP6V1B1-AS1在非小細胞肺癌診斷和治療中的作用提供了方向。然而，本研究中尚未進行體內實驗明確ATP6V1B1-AS1在體內環境中對于非小細胞肺癌增殖、侵襲的作用，并且對于下游ceRNA網絡中相關基因的結合具體位點和結合方式有待進一步論證。