微生物對黃曲霉毒素去除的研究進展

常程程， 丁梓雪， 王彥欽， 楊 帆， 孟憲剛

（蘭州交通大學生物與制藥工程學院，甘肅 蘭州 730000）

黃曲霉毒素是由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等真菌產生的次級代謝產物， 主要是由一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮組成，是二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素有20 多種，常見的有AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。 其中AFB1的毒性最強，危害最大，因此被用來作為AF 的評價指標（謝慧等，2020）。 玉米、小麥、花生、玉米秸稈等農產品因貯存不當或其他原因都會污染黃曲霉毒素。全世界范圍內，每年有1600 萬t 糧食受到黃曲霉毒素污染，給農業生產造成巨大的經濟損失。

黃曲霉毒素具有極強的毒性和致癌性， 威脅農業發展、糧食安全和人類健康。土壤中存在黃曲霉毒素的污染，可引起土壤理化性質改變，土質退化，使農作物枯萎減產（王曉艷等，2021）。 中國食品中黃曲霉毒素允許量標準（μg/kg）為：花生油、堅果和干果中AFB1≤20 μg/kg；玉米、花生仁制品中AFB1≤20 μg/kg；大米及其他食用油中AFB1≤10 μg/kg；面粉、發酵食品、淀粉類制品中AFB1≤5 μg/kg。 攝入后，AFB1和AFB2被肝臟代謝成它們的羥基化代謝物M1（AFM1）和M2（AFM2），它們可以在尿液、糞便中排泄（Tozzi 等，2016），可導致人和牲畜營養代謝不良、不孕、先天畸形、內分泌紊亂 （邢福國等，2021；Valencia-Quintana 等，2020），嚴重時可誘發肝臟疾病，導致肝癌，對人體的免疫系統具有極大的危害性。 連續攝入少量黃曲霉毒素會慢性中毒， 一次攝入大量的黃曲霉毒素會中毒死亡（羅昱芬，2017；關心，2016）。

1 黃曲霉毒素的常見去除方法

實現糧食中黃曲霉毒素的去除， 可以通過主動預防和被動去除兩種方式，目前常用的降解AF的方法主要有物理方法、化學方法和生物方法。

1.1 物理法 物理法通過高溫加熱、吸附、紫外線照射、 超聲和低溫等離子體技術等方式（Wu等，2021），破壞細胞膜及DNA，防止細胞復制，殺死黃曲霉， 或使毒素結構破壞使呋喃環的化學鍵斷開，或通過吸附劑將AFB1吸附，從而達到去除AFB1的效果 （賀冰，2016）。 張小勇等 （2015）用254、365 nm 和420 nm 三種不同波長的紫外燈照射大豆油脂，并對黃曲霉毒素B1去除情況進行了比較，發現365 nm 波長紫外燈的去除效果最佳，為96.4%，達到食用油衛生標準要求，但油脂、酸值及過氧化值升高，對油脂的質量有一定影響。其優點是時間短、見效快，如紫外線輻射具有很強的殺菌能力， 但紫外線輻射需要在特定波長下才能起作用，深度有限，存在降解不徹底的問題，且對糧食的質量和營養價值有一定影響。

1.2 化學法 化學法是在加工過程中使用化學物質與黃曲霉毒素發生反應， 將黃曲霉毒素轉化為無毒或低毒的產物， 達到去除黃曲霉毒素的效果，常用的方法有強酸強堿處理法、臭氧熏蒸法、電解水技術等（盧丹等，2018）。強堿處理可以破壞黃曲霉毒素的內酯環， 生成香豆素和無毒的鈉鹽（劉暢等，2010）。 楊威（2019）用一定pH 的NaOH液處理脫皮破碎的花生， 一段時間后花生油中AFB1含量逐漸降低，AFB1脫除率達98.0%， 但在處理過程中，酸價和碘值在國標規定范圍內，過氧化值超出了國標限定值。 化學物質對毒素降解徹底，有極強的滅活能力，但化學法成本高，操作復雜，具有一定危險性，且容易發生二次污染，會有殘留，用于糧食作物營養成分流失很大，在大多數情況下應用起來較為困難。

1.3 生物法 生物手段防控真菌污染是一種綠色、安全、高效的方法，包括微生物或植物提取物對黃曲霉毒素進行吸附去除或分解代謝， 或是利用微生物的代謝產物拮抗真菌， 并控制環境條件（光照、水分和溫度等），抑制黃曲霉的孢子萌發和生長。 生物方法脫毒反應條件溫和、專一性強、成本低，具有較高的防控效果和應用前景。

2 黃曲霉毒素的微生物去除方法

微生物去毒方法主要包括菌體吸附和生物降解兩種方式，近年來，已被證實許多細菌和真菌都有去除黃曲霉毒素的能力，如芽孢桿菌、腸桿菌、乳酸菌、沙雷氏菌、假單胞菌、紅球菌、米曲霉和黑曲霉等 （趙雪芹等，2020； 張盼等，2015；Deepak等，2015；楊文華，2013；翟翠萍等，2012）。 微生物通過酶促反應破壞AFB1的毒性結構位點雙呋喃環末端雙鍵、內酯環和環戊烯酮環，產生無毒無害的降解產物。

2.1 微生物對黃曲霉毒素的吸附作用 在微生物吸附方面，研究最多的是酵母菌和乳酸菌，吸附方式主要為物理結合， 它們可以通過菌壁上的多糖（如肽聚糖和磷壁酸）有效地結合黃曲霉（Guan等，2021）。菌體通過細胞壁的特殊結構和成分、官能團之間的化學鍵、 大分子之間的作用力和表面張力等與黃曲霉毒素結合在一起， 形成微生物-毒素復合體。

酵母菌和乳酸桿菌具有良好的吸附能力和發酵能力， 因此它們在黃曲霉毒素脫毒過程中能發揮重要作用（Aazami 等，2018）。 布拉酵母菌具有良好的益生效果，楚杰（2013）發現布拉酵母菌脫除AFB1的主要機理是吸附作用， 在處理30 min，pH為8.0 時對AFB1去除率達到60%以上。 劉暢（2010）從傳統自制發酵食品中分離到的11 種益生菌中， 發現菌株釀酒酵母Y1 對AFB1的吸附率可達32.11%， 經100 ℃加熱滅活后， 吸附率顯著上升，達到49.53%。 通過掃描及透射電鏡觀察，加熱后菌體表面凹凸不平，細胞壁厚度增加，說明菌體加熱后由于接觸面積增加，提高了對AFB1的吸附能力。錢潘攀等（2017）用麝香草酚裂解并殺死酵母細胞，使細胞壁上肽聚糖的結構改變，提取酵母膜脂與細胞壁制成去毒劑，使其具有抑制黃曲霉孢子萌發和吸附毒素的雙重能力。用薄層層析和液相色譜進行檢測，發現該提取物對黃曲霉毒素的吸附能力為2.5 μg/mg。 Haidukowski（2019）將食用菌菌絲體制成新型的吸附劑，結果表明，杏鮑菇非活菌絲體對AFB1的吸附率能達到85%，采用因子設計模型（DOE）比較多個因素對吸附率的影響，并進行條件優化后，側耳菌絲體吸附率達到90.7%。

革蘭氏陽性菌的細胞壁中含有大量的肽聚糖、多糖和蛋白質，具有霉菌毒素吸附位點，故而成為吸附黃曲霉毒素的典型菌。 蔣采貝等（2019）研究了植物乳桿菌對AFB1的吸附能力和吸附特性，進行單因素試驗確定最佳條件后，吸附率最大值為58%， 熱致死菌體后對AFB1的吸附能力有明顯提高， 表明在吸附過程中起作用的主要部位是細胞壁上的蛋白質和多糖等成分， 其多糖和肽聚糖對熱處理敏感。 唐纓等（2020）從西北酸菜培養物中分離出20 株具有黃曲霉毒素脫除能力的菌株，脫除率為18.37% ～65.06%，將脫毒能力最強的菌株進行生理生化鑒定及16S rDNA 序列分析并構建系統發育樹，鑒定為布氏乳桿菌。菌液離心后經PBS 多次洗脫后，AFB1逐漸釋放， 菌株吸附率由65.06%逐漸下降至53.7%，說明該菌株對毒素的吸附取決于菌種自身的特異性， 雖然在過程中會有結合不緊密的毒素解離下來， 但是在多次洗脫后仍然保持較高的穩定性。

生物吸附是一種有效的去除黃曲霉毒素的方式， 通過菌體結合毒素可以達到高效去除毒素的目的，但在試驗過程中，隨著時間的延長，吸附率會逐漸下降， 與微生物結合不緊密的毒素會解離下來， 這表明吸附是一種可逆的過程。 Wacoo（2019）將飲料中提取的鼠李糖乳桿菌Yoba 和嗜熱鏈球菌C106 制成發酵菌劑，30 ℃發酵24 h 能將黃曲霉毒素降低到無法檢測到的水平， 體外熒光試驗證實Yoba 細菌在該過程中與AFB1結合，但單靠吸附并不能達到這種效果， 推測其中既有菌體吸附，也有降解作用。

2.2 微生物對黃曲霉毒素的降解作用 近年來，國內外關于微生物降解黃曲霉毒素做了很多研究，金佳佳（2019）以香豆素為唯一碳源，從發酵食品、豆類、土壤、動物腸道及培養物中篩選出9 株能夠去除黃曲霉毒素的菌株， 其中去除能力最高為90.7%，菌液與毒素反應后，經反復洗脫、萃取，萃取液中毒素的提取率極低，證明該菌株對AFB1有降解作用， 經生理生化及分子生物學鑒定為枯草芽孢桿菌。 董慧燕（2021）分離了一株對AFB1有降解能力的菌株， 經生理生化和分子生物學鑒定，為銅綠假單胞菌，編號M4，通過單因素試驗和響應面優化試驗確定最佳發酵條件， 將降解率從初始的34.10%提高到96.17%。 郭鈺婷（2019）以香豆素為唯一碳氮源，從動物糞便、發霉的糧食、土壤中篩選出一株可以降解AFB1的綠膿桿菌，發現其對降解起主要作用的是上清液。 邱天宇（2020）從醬醅中篩選出一株具有降解黃曲霉毒素能力的FS10 黑曲霉菌株， 優化發酵條件后，對AFB1的降解率為95.01%， 且對花生粕中的四種黃曲霉毒素都具有較高的降解能力。 王海云（2013）從發霉的土壤和酒糟中取樣，篩選出7 株菌， 其中4 種菌對AFB1的降解能力均在70%以上，經過鑒定，兩種菌為芽孢桿菌，兩種為短桿菌。

黃曲霉毒素的降解過程中， 共培養的菌株降解能力往往優于單一的菌株， 兩種或多種菌株之間可能具有協同或互作。Wang（2013）從土壤樣品中分離出兩種菌，將其混合培養后并未相互抑制。兩種菌株的上清液對毒素的降解率分別為30.2%和36.5%，共培養后上清液降解率達到87.7%，相比單獨培養提高了對AFB1的降解率和降解速率，使上清液中蛋白含量和解毒酶含量升高，經鑒定，兩種菌均為芽孢桿菌。王康（2020）測定兩種芽孢桿菌的降解率為70.65%和61.42%， 將菌株組合并優化培養條件后降解率達到88.95%，說明結合菌株進行混合培養的效果高于單一菌株。

本團隊早期研究通過使用液相色譜串聯三重四級桿質譜（UPLC-MS）及核磁共振氫譜，檢測枯草芽孢桿菌WTX1 降解黃曲霉毒素后的產物，得到5 種主要產物，推測菌株降解作用于香蘭素內脂環和戊烯酮環結構，并破壞呋喃環8，9 位的碳碳雙鍵， 進行細胞毒理學試驗得出降解后的產物對細胞形態、活性影響均不顯著，說明此菌株具有顯著解毒效果（唐瓔等，2021；唐瓔等，2021）。

2.3 降解AFB1的酶 菌體中的活性物質如肽、細菌素、有機酸、小分子有機物等對黃曲霉均有抑制、拮抗的效果（王昌祿等，2021），但在降解過程中，發揮作用的主要是菌體中的酶，其多存在于細胞內容物或胞外上清液中。近年來，利用真菌和細菌生物降解霉菌毒素已成為科研人員研究的熱點， 微生物降解霉菌毒素的機理實質上就是在解毒酶作用下發生酶促降解，改變毒素的原始結構，形成低毒或無毒的新物質（紀俊敏等，2021）。

密環菌其產生的胞內酶AFO 是二肽基肽酶III（DPP III）家族的典型成員（Guan 等，2015），可以作用于AFB1的呋喃環的稀醚鍵并將其轉化為環氧化物。 水解生成低毒的AFB1-8，9-二氫二醇以達到解毒的目的 （Wang 等，2019）。 Guan 等（2021）從玉米、水稻和土壤中分離出了能降解黃曲霉毒素的芽孢桿菌， 提取出一種降解酶（BADE），具有熱穩定性，在70 ℃、pH 為8.0 時表現出最高的降解活性， 生成了新物質。 宋茂鵬等（2021）發現降解AFB1的主要活性物質位于假單胞菌的上清液中，HPLC 結果顯示72 h 后AFB1峰面積明顯小于對照組。 岳曉禹等（2017）發現嗜麥芽窄食單胞菌的胞外粗提液的降解能力最強，進一步研究發現該活性物質主要是菌株的胞外代謝產物，推測為胞外酶類。Wang 等（2017）從AFB1平菇菌絲懸浮液和黑曲霉的分生孢子的混合液中過濾提取出解毒酶， 分子質量分別為58 kDa 和63 kDa 的解毒酶對AFB 具有較高的降解性。 通過液相色譜-質譜的方法聯用確定了8 種降解產物的具體成分和結構公式，其毒性都較小或無毒，證明混合真菌培養物促進了解毒酶的產生， 這可能比單獨的菌株降解AFB1更有效。 李文明（2013）用施氏假單胞菌內的物質，用液相色譜串聯質譜法，AFB1生成兩種新物質。

在具有降解能力的菌株中， 許多酶對黃曲霉毒素具有較強的降解能力， 包括水解酶（Alberts等，2009）、過氧化物酶（Yehia 等，2014）、氧化還原酶（Xu 等，2017；Li 等，2019）。AFB1包含呋喃部分和內酯環部分。 末端呋喃環上的雙鍵是AFB1癌癥和毒性的關鍵活性位點（賀冰，2016）。酶可以直接或間接作用于末端呋喃環中雙鍵或碳位點，降低或消除毒性（Wajiha 等，2016）。

漆酶已被證實具有對黃曲霉毒素的降解能力（姜宏等，2021），其作用于黃曲霉毒素的二呋喃環對其直接氧化（盧丹等，2018）。真菌錳過氧化物酶可以降解包括黃曲霉毒素在內的四種真菌毒素，Wang（2019）從枯草芽孢桿菌中克隆出染料脫色過氧化物酶（DYP）基因，在大腸桿菌BL21 中表達，重組BsDyP 可以有效地降解AFB1，其在48 h內被純化的BsDyP 降解至76.93%， 降解后AFB1呋喃環8，9 號位的碳碳雙鍵被氧化， 加上兩個羥基生成醇， 生成的AFB1-二醇的毒性小于AFB1。Qin（2021）發現在二羧酸丙二酸鹽存在下，八種錳過氧化物能夠降解四種主要的霉菌毒素， 包括AFB1，其中自由基起重要作用。 但錳過氧化物酶（MnPs）難以大量獲得，可以在畢赤酵母（Jiang 等，2008）或絲狀真菌（Conesa 等，2002）中獲得，然而它們很難重組表達， 如未來可以把精力放在基因工程中常用的平臺工業微生物上，或可促進MnPs的大規模異源生產。

酶不易保存， 隨時間變化酶易鈍化， 失去活性。 降解酶的產生與分泌是否受毒素的誘導，單獨的酶對毒素的降解能力不如宿主菌株有效，因此真菌毒素的降解往往需要幾個或多個酶協同并發揮作用，且降解途徑并不明確，其具體機制還需要深入研究。 另外，在實際操作中存在一定難度，是否能夠將降解酶混合或制成制劑大批量生產投入應用，還有待進一步研究。

3 結論與展望

花生、玉米、小麥等眾多糧食在儲存與運輸過程中都會受到黃曲霉毒素的污染， 其毒性與致癌性極強，通過食物鏈的傳遞，危害牲畜與人類的健康。 因此研究一種高效、環保、安全的去毒方式和防控策略勢在必行。

黃曲霉毒素由黃曲霉菌和寄生曲霉產生，受到光照、溫度、濕度等環境因素影響，在此基礎上尋找一種能保持糧食營養價值的去毒方法應用于農業迫在眉睫。 現有的物理法包括加熱、吸附、紫外線照射、超聲和低溫等離子體技術等方式，去除毒素速度快，但降解不徹底，有殘留。 化學法通過化學反應將毒素轉化為低毒或無毒產物， 常用的方法有強酸強堿處理法、臭氧熏蒸法、電解水技術等。化學法降解徹底，但操作復雜，成本高，且化學藥品的殘留容易發生二次污染，不能達到綠色、安全的期望。 生物去除法通過微生物細胞壁等特殊結構吸附毒素，將糧食與毒素分離；或通過微生物的生長特性， 利用黃曲霉毒素作為自身生長的碳源，達到降解的目的。生物去除方法可以有效的去除毒素并保證食品品質，無毒無害，有很強的特異性和生物安全性。

因此利用微生物去除黃曲霉毒素是最有潛力和發展前景的方法， 篩選出對黃曲霉毒素具有高效拮抗作用的菌株是防治毒素污染領域研究的熱點之一，研究發現芽孢桿菌、假單胞菌、乳酸菌、酵母菌等對黃曲霉毒素有拮抗作用， 分離出微生物中的活性物質， 并進一步研究以闡明黃曲霉毒素的降解機制， 是今后防治真菌毒素污染應用的重要基礎研究工作。