QuEChERS前處理結合UPLC-MS/MS法測定枸杞中19種外源性風險物質殘留量*

胡紫艷，史達，張珂，金鑫，陳鐳，張玲

(南京市食品藥品監督檢驗院，南京 210000)

枸杞(Lyciumbarbarum)是國家衛生健康委員會公布的藥食同源品種之一，既是人們日常保健、滋補佳品，也是傳統中藥材，含有豐富的多糖、萜類、黃酮和生物堿等多種活性成分和氨基酸、礦物質等營養成分[1-2]，其生物活性成分在抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]，以及改善腸道微環境[6]等多方面具有顯著的生理活性和藥用價值。枸杞等中藥材在培育、生長發育過程中存在廣泛使用有機磷類禁用農藥和植物生長調節劑的現象[7-8]，但由于使用不規范，有機磷類禁用農藥和植物生長調節劑的殘留量超標現象日益明顯，嚴重影響其品質和使用安全。近年來，出口枸杞因禁用農藥和植物生長調節劑殘留超標遭遇退運或銷毀的事件時常發生，是枸杞出口面臨的主要技術性貿易壁壘[9-10]。2020年版《中華人民共和國藥典》未針對性的設置枸杞種植過程中常用農藥和植物調節劑殘留量檢查項目。

QuEChERS前處理技術是由美國農業部Anastassiades M教授提出的，基于固相萃取(solid-phase extraction，SPE)和基質固相分散(matrix solid-phase dispersion，MSPD)技術改進發展的一種前處理方式。通過選用合適的固相萃取吸附劑，隨同樣品分散到萃取液中，吸附干擾物，保留目標物，以實現快速(quick)、簡單(easy)廉價(cheap)、高效(effective)、穩定(rugged)和安全(safe)的凈化基質，以滿足分析檢測要求[11]。目前，QuEChERS技術已廣泛應用于食品、中藥材等復雜基質中農藥、植物生長調節劑風險物質殘留量檢測的前處理過程中[12-13]。

因此，本文選用枸杞種植過程中常用的13種禁用有機磷類農藥和6種植物生長調節劑為研究對象，建立一種基于QuEChERS提取凈化和超高液相色譜-三重四級桿串聯質譜聯用(UPLC-MS/MS)的檢測方法，為枸杞中農藥殘留分析檢測提供一種快速、可靠的分析方法，并應用該方法對市售50批枸杞進行19種外源性風險物質殘留量的測定，以保證枸杞質量安全。

1 儀器與試藥

1.1儀器 UPLC-MS/MS 6470液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀(美國安捷倫公司)；XS205DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.1 mg)；DC24H氮吹儀(上海安譜科學儀器有限公司)；ALLEGRAX-30R高速離心機(貝克曼庫爾特有限公司)；Milli-Q超純水儀(德國默克集團)；KQ-800DE超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TM-2F渦旋振蕩器(德國WIGGENS集團)；QuEChERS萃取鹽包(無水硫酸鎂、醋酸鈉)，QuEChERS凈化包(無水硫酸鎂、PSA和C18EC，美國安捷倫公司)。

1.2藥品與試劑 乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，德國Fluka公司)；乙酸銨為色譜純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；試驗用水為超純水。

用于質量分析的19種外源性風險物質標準品信息見表1，以乙腈為溶劑，稀釋19種標準品的濃度為10 μg·mL-1，作為混合標準儲備液，置于-18 ℃冰箱儲存。50批市售枸杞樣品產自寧夏、青海、新疆、河北等地。

表1 標準物質的相關信息

2 方法與結果

2.1色譜條件 采用Agilent HD C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫40 ℃；流動相A為5 mmol·L-1醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈，流速為0.3 mL·min-1。梯度洗脫(0～2.0 min，95% A；2.0～5.0 min，95%→25% A；5.0～9.0 min，25%→10% A)。

2.2質譜條件 電噴霧離子源，正負離子同時掃描；多反應監測(MRM)模式；毛細管電壓：4000 V(+)3500 V(-)；霧化氣：氮氣(N2)；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：6 L·min-1；噴霧電壓：500 V；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L·min-1。19種外源性風險物質主要質譜參數見表2。

表2 19種外源性風險物質主要質譜參數

2.3標準溶液配制 混合標準溶液：分別準確移取各農藥標準儲備液1 mL于同一50 mL量瓶中，用乙腈定容，配制成200 ng·mL-1的混合標準溶液，置于-18 ℃冰箱保存。

標準工作溶液：準確移取適量混合標準溶液，用乙腈稀釋，配制成質量濃度為5，10，50，100，200 ng·mL-1的混合標準工作溶液。

2.4樣品前處理

2.4.1提取 精密稱取粉碎后枸杞(5.0 g)置50 mL離心管中，精密加1%甲酸溶液15 mL和一粒陶瓷均質子，渦旋使藥物充分浸潤，放置30 min，再精密加入乙腈(色譜級)15 mL，渦旋5 min，加QuEChERS萃取鹽包(無水硫酸鎂6 g和無水醋酸鈉1.5 g)，立即搖散，置振蕩器上劇烈振搖3 min，于冰浴中冷卻10 min，8000 r·min-1(r=93 mm)，離心5 min。

2.4.2凈化 精密移取清液10 mL置分散固相萃取凈化管(900 mg無水硫酸鎂、150 mg PSA、150 mg C18EC)中，渦旋充分混勻，再置振蕩器上劇烈震蕩5 min，8000 r·min-1，離心5 min，精密取上清液5 mL于玻璃試管中，置氮吹儀上濃縮至0.4 mL(40 ℃)，加乙腈至約0.9 mL，渦旋混勻約15 s，再用乙腈定容到1 mL，渦旋混勻15 s。

2.5方法學考察

2.5.1線性關系考察 取未檢出19種外源性風險物質的枸杞樣品(編號：Q190805)，按“2.4”項下方法處理得到的提取溶液為溶劑，加適量混合標準溶液，分別配制5，10，50，100，200 ng·mL-1的系列基質標準工作溶液，以標準溶液質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準工作曲線。實驗結果表明，19種外源性風險物質濃度在5～200 ng·mL-1范圍內，標準曲線相關系數(r)均大于0.995，分析結果見表3。19種外源性風險物質典型色譜圖見圖1。

圖1 19種外源性風險物質典型定性、定量離子色譜圖

續圖1 19種外源性風險物質典型定性、定量離子色譜圖

2.5.2回收率和重復性 取未檢出19種外源性風險物質的枸杞樣品(編號：Q190805)，粉碎后精密稱取5.0 g，作為空白基質樣品，分別精密加入濃度為100 ng·mL-1的混合標準溶液125，250，1.25 mL，按“2.4”項下方法處理，得到12.5，25，125 ng·mL-1，3個水平的模擬樣品考察回收率，每個濃度制備6份平行樣品，19種外源性風險物質的回收率平均值在87.2%～115.1%，重復性RSD≤15%，見表3。說明該方法對枸杞中19種外源性風險物質的測定，具有良好的準確度和重復性。

2.5.3穩定性 取“2.5.1”項下混合對照溶液和“2.5.2”項下樣品加標溶液，在室溫下分別于0，2，4，6，8 h進樣，測定19種外源性風險物質的峰面積，結果19種外源性風險物質的峰面積RSD均<12%，說明混合對照品溶液和樣品加標溶液在室溫8 h內穩定。

2.5.4檢出限與定量限 取“2.5.1”項下濃度為5 ng·mL-1混合對照溶液，采用逐級稀釋法稀釋，以信噪比S/N≥3時樣品中待測物的含量為檢出限，S/N≥10時為定量限，19種外源性風險物質的檢出限和定量限結果見表3。

表3 19種外源性風險物質線性方程、相關系數、加樣回收率、精密度、檢出限、定量限和基質效應

2.5.5基質效應評價 基質效應(ME)是指基質成分和目標化合物在進行離子化時，因相互競爭而導致目標化合物信號強度有不同程度增強或減弱的現象，包括基質增強效應和基質抑制效應。本文采用提取后添加法，將陰性枸杞樣品按“2.4”項方法處理，得空白基質溶液。分別用空白基質溶液和純溶劑配制標準曲線，按以下公式計算基質效應。

基質效應(%)=(空白基質標曲的斜率-溶劑標曲的斜率)/溶劑標曲的斜率×100%

基質效應在±20%以內為弱基質效應，在±50%以內為中等基質效應。研究結果發現，19種外源性風險物質存在不同程度的基質效應，基質效應均在±30%以內，為減小基質效應的影響，本文采用空白基質溶液配制標準曲線進行定量。

2.5.6樣品測定 采用優化后的方法對市售不同產地的50批次枸杞樣品進行19種外源性風險物質殘留量的檢測，以色譜峰的保留時間、定性離子與定量離子豐度比進行定性分析，定量離子對進行定量分析。其中18批檢出矮壯素、助壯素、4-硝基苯酚鈉植物生長調節劑殘留；11批檢出克百威、治螟磷2種禁用農藥，50批樣品來源信息和檢測結果見表4。

表4 50批樣品來源信息和檢測結果

續表4 50批樣品來源信息和檢測結果

3 討論

3.1UPLC-MS/MS條件的優化 采用不接分析柱的方式向質譜系統注入1 μg·mL-1標準溶液1 μL，確定各化合物的響應最高的2個特征離子對、碎裂電壓和碰撞能量等質譜最佳條件。在流動相的選擇中，分別比較了甲醇與乙腈兩種有機相，實驗結果發現，乙腈為有機相的分離效果略優于甲醇，故采用乙腈為有機相。考察了水、0.1%甲酸溶液和5 mmol·L-1醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)3種水相，實驗結果發現，5 mmol·L-1醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)能夠顯著提高化合物的響應，且在一定程度上能緩解色譜峰拖尾。

3.2提取、凈化條件選擇 枸杞基質較為復雜，含有多糖、有機酸、蛋白質、脂肪、色素[14]等多種物質干擾測定，乙腈因具有較好的共萃性和分層性，是農藥殘留檢測中常用的提取溶劑，本文研究參照《中華人民共和國藥典》四部通則2341農藥殘留量測定法、《食品安全國家標準》中水果蔬的農殘提取方法以及文獻[15-17]方法，優化提取、凈化條件，枸杞中水的存在會導致部分疏水性較強的植物生長調節劑回收率極低，因此加入萃取鹽包除去樣品中水分，提高萃取效率；凈化管中PSA可凈化枸杞中有機酸、糖類和部分色素，C18EC可以有效凈化酯類。

在中藥高質量發展的推動下，科學有效地評價中藥質量是當前質量控制中研究的重點和難點，目前對中藥質量標準研究仍然停留在對有效成分的研究，缺少安全性的評價[18-19]。枸杞作為我國中藥材走向世界的代表之一，如何利用現代分析技術和檢測設備多元化的分析及評價枸杞質量是我們要解決的問題。

枸杞在種植過程中廣泛使用農藥和植物調節劑帶來的殘留問題已引起國內外普遍關注。有機磷類禁用農藥具有類雌激素和“三致”(致癌、致畸、致誘變)作用，并易堆積于肝、腎、脾等組織中，導致急性或慢性中毒。植物生長調節劑，會影響中藥材的有效性和安全性，主要體現為顯著影響中藥材化學成分的積累量和組成比，其在藥材中的殘留會危害服用者身體健康，盲目使用帶來的高殘留會引起肝毒性、生殖毒性、免疫毒性等[20]。

本論文通過應用QuEChERS凈化，以液相色譜-質譜/質譜法建立了同時檢測枸杞中19種有機磷農藥和植物生長調節劑等外源性風險物質殘留量的方法。實驗分別對前處理方法、色譜質譜條件進行了優化，采用多反應監測模式檢測，測定了枸杞種植過程中可能使用的有機磷類禁用農藥和植物生長調節劑類。該方法具有靈敏度高、普適性強、操作簡便等優點，適用于枸杞農藥殘留量的測定，可為保障枸杞食用、藥用安全提供有效的技術支撐。