基于整合藥理學及體外實驗探索生血補髓湯治療股骨頭壞死作用機制

周毅 ，趙赫然 ，章曉云 ，張璇 ，陳躍平 ，陳雷雷

1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530011； 2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510378；3.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011； 4.廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510378；5.廣東省中醫骨傷研究院，廣東 廣州 510378

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是臨床常見的骨科難治疾病，以髖關節疼痛和功能障礙為臨床表現[1]。流行病學研究顯示，目前全世界有ONFH患者約2 000多萬例，其中，中國約有800萬例，并且以每年10～20萬例的速度增加[2-3]。ONFH與脂質代謝異常、血管內凝血、成脂分化、細胞凋亡自噬、骨質疏松、基因多態性等密切相關[4]。ONFH屬中醫學“骨蝕”“骨痹”“骨痿”范疇，與肝腎虧虛、外邪侵襲、氣滯血瘀密切相關，治療以活血化瘀為主，輔以通絡止痛、健脾化濕、補腎健骨等[5-6]。

生血補髓湯出自《傷科補要》，具有益氣補血、補髓壯骨之功。謝本淵等[7]運用生血補髓湯配合膏藥外敷治療早期ONFH，發現該方可通過補益氣血，調節免疫功能，改善股骨頭血運，取得良好療效。本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法（UPLC-QTOF-MS）對生血補髓湯湯劑進行成分鑒定，再運用中醫藥整合藥理學研究平臺（TCMIP）2.0進行網絡藥理學分析，基于質譜鑒定、網絡藥理學預測結果和文獻分析，構建生血補髓湯單體復方，進行體外實驗驗證，以探究生血補髓湯干預ONFH的作用機制。

1 儀器、試藥與細胞

Ultimate3000超高效液相色譜儀（賽默飛世爾有限公司），TripleTOF?5600（美國AB Sciex公司），Analyst TF1.7工作站（美國AB Sciex公司），5810R型離心機（SIGMA公司），DMI3000B型倒置顯微鏡（德國Leica公司），CFX96 Touch型熒光定量PCR儀（美國BioRad公司），T100型梯度PCR儀（美國BioRad公司）。

TRAP染色試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號G1050-50T），CCK-8試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號KGA317-1），胎牛血清（依科賽生物科技有限公司，批號FSS100），巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF，蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，批號CB34），小鼠RANKL（派普泰克生物科技有限公司，貨號315-11C），活性氧（ROS）檢測試劑盒（索萊寶生物科技有限公司，批號CA1410），總RNA小量提取試劑盒（廣州億濤生物科技有限公司，批號EK1300）， TB Green?Premix Ex TaqTMqPCR Kit（Takara，批號RR420Q），反轉錄試劑盒（艾科瑞生物工程有限公司，批號AG11706），高糖DMEM培養基（賽默飛世爾有限公司，批號PM150210P）。對照品阿魏酸、綠原酸、梓醇、芍藥苷、槲皮素、山柰酚，索萊寶生物科技有限公司，批號分別為SF8030、SC8210、SC8150、SP8030、SQ8030、SB8020，純度均不低于98%。

RAW264.7細胞，武漢普諾賽公司，批號CL-0190。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

生血補髓湯（生地黃12 g，白芍9 g，川芎6 g，黃芪9 g，鹽牛膝9 g，鹽杜仲9 g，紅花5 g，南五加皮9 g，當歸9 g，鹽續斷9 g）飲片，購于廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院中藥房，加1 000 mL水浸泡30 min后煮沸，繼續煎煮30 min，得頭煎液300 mL，藥渣加500 mL水，同法獲得二煎液200 mL，合并2次煎液，室溫放涼，混勻后取50 mL樣品，1 000 r/min離心20 min，取上清液，即得。

2.2 色譜條件和質譜條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫40 ℃，上樣量3 μL，流速400 μL/min，流動相正離子模式為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），負離子模式為2 mmol/L乙酸銨（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1.5 min，5%B；1.5～2.5 min，10%B；2.5～14.00 min，10%～40%B； 14.00～22.00 min， 40%～95%B； 22.00～25.00 min，95%B；25.00～26.00 min，95%～5%B；26.00～30.00 min，5%B）。

采用Analyst TF 1.7軟件中的IDA功能進行一、二級質譜數據采集，在每個數據采集循環篩選出強度最強且＞100的分子離子，以獲得相應的二級質譜數據。一級質譜采集范圍m/z 50～1 200，轟擊能量30 eV，每50 ms 10張二級譜圖。電噴霧離子源（ESI），霧化氣壓60 psi，輔助氣壓60 psi，氣簾氣壓35 psi，離子源溫度650 ℃，噴霧電壓5.0 kV（正）、-4.0 kV（負）。

2.3 活性成分鑒定

將原始數據導入MSDIAL4.6軟件進行峰尋找、峰對齊等處理，利用前期建立的生血補髓湯10味中藥化學成分、質譜數據庫，同時整合Metlin、MassBank、MoNA和HMDB公共數據庫，扣除空白樣品得到鑒定結果。鑒定過程中進行一級質譜數據比對（相對誤差＜10 ppm），在此基礎上通過二級質譜分析及文獻[8-17]比對，進一步對活性成分進行確認。

2.4 生血補髓湯治療股骨頭壞死潛在靶點

將初步鑒定得到生血補髓湯活性成分導入TCMIP2.0，使用活性成分靶點預測功能，以相似性分數≥0.8為標準進行篩選[18]；以“Osteonecrosis of the Femoral Head”“Femur Head Necrosis”為關鍵詞，通過“疾病相關分子挖掘及其功能分析模塊”收集相關靶點；使用“中醫藥關聯網絡挖掘”版塊的“疾病-方劑”網絡模塊，分別上傳生血補髓湯和ONFH的候選靶點群。以度值（degree）、介度值（betweenness）和緊密度（closeness）作為篩選指標，以三者均大于中位數的節點作為分析靶點。同時，選取該靶點群中的生血補髓湯和ONFH共有靶點作為生血補髓湯治療ONFH靶點。

2.5 蛋白相互作用網絡分析

將核心靶點上傳到STRING11.0平臺進行蛋白相互作用（PPI）網絡分析，并將TSV格式文件輸入Cytoscape3.7.2軟件進行網絡構建和拓撲學分析，計算PPI網絡中各節點的度值和介度值。度值越大表明該節點在網絡中的重要性越強，介度值越大表明該節點在網絡信息傳遞中發揮的作用越重要，即靶點越處于網絡中心。

2.6 GO生物過程和KEGG通路富集分析

利用DAVID6.8數據庫，通過GO富集分析核心靶點的生物過程，KEGG富集分析其相關通路，選取P＜0.05的富集結果，并使用R語言軟件繪圖。

2.7 多維網絡分析

根據藥物活性成分及其預測靶點，結合KEGG通路富集分析結果，采用Cytoscape3.7.2軟件構建生血補髓湯治療ONFH的中藥-成分-靶點-通路多維網絡，并進行網絡拓撲分析。

2.8 細胞實驗

2.8.1 生血補髓湯單體復方制備

根據質譜分析和TCMIP預測結果，選取滿足以下條件的單體組成新的單體復方用于實驗：①生血補髓湯組方藥物的主要活性成分或質量標志物且在質譜分析中檢測出的成分，如梓醇為生地黃質量控制的指標性成分，阿魏酸為當歸和川芎的主要活性成分[19]，綠原酸為五加皮的主要活性成分[20-21]，芍藥苷為白芍的主要活性成分[22]；②TCMIP預測結果中存在較多治療靶點的活性成分（如槲皮素、山柰酚均有13個靶點）；③排除氨基酸、核苷類、生物堿類廣泛存在于各種藥材中不具備代表性的活性成分。

參考活性成分使用說明書制備生血補髓湯單體復方。①低濃度：梓醇1.5 μg/mL、芍藥苷17 μg/mL、阿魏酸1.25 μg/mL、綠原酸17.5 μg/mL、槲皮素15 μg/mL、山柰酚14 μg/mL；②中濃度：梓醇3 μg/mL、芍藥苷31 μg/mL、阿魏酸2.5 μg/mL、綠原酸35 μg/mL、槲皮素30 μg/mL、山柰酚28 μg/mL；③高濃度：梓醇6 μg/mL、芍藥苷62 μg/mL、阿魏酸5 μg/mL、綠原酸70 μg/mL、槲皮素60 μg/mL、山柰酚56 μg/mL。

2.8.2 CCK-8法檢測細胞活力

取對數生長期RAW264.7細胞，以6×103個/孔接種于96孔板，每孔加入100 μL細胞液，培養過夜。實驗分為空白對照組（含10%胎牛血清的高糖培養基H-DMEM）、RANKL組（RANKL 100 ng/mL+M-CSF 50 ng/mL+含10%胎牛血清的高糖培養基H-DMEM）和單體復方組（不同濃度生血補髓湯單體復方+RANKL 100 ng/mL+M-CSF 50 ng/mL+含10%胎牛血清的高糖培養基H-DMEM），每組4個復孔，干預6、12、24 h，每孔加入含10 μL CCK-8的培養基，37 ℃、5%CO2條件下避光培養1 h，于酶標儀450 nm波長處檢測各孔吸光度（OD值）。

2.8.3 分組及干預

取生長狀態良好的RAW264.7細胞，以6×103細胞量接種到6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，分為空白對照組（含10%胎牛血清的高糖培養基H-DMEM）、RANKL組（RANKL 100 ng/mL+M-CSF 50 ng/mL+含10%胎牛血清的高糖培養基H-DMEM）、高濃度單體復方組（高濃度生血補髓湯單體復方+RANKL 100 ng/mL+M-CSF 50 ng/mL+含10%胎牛血清的高糖培養基H-DMEM），過夜后按以上分組進行破骨細胞誘導，持續5 d。

2.8.4 TRAP染色檢測細胞破骨分化

各組細胞于12孔板干預5 d，按TRAP染色試劑盒使用說明進行染色，置于顯微鏡下觀察、拍照，多核（細胞核≥3個）、胞體較大、酒紅色細胞為成熟破骨細胞。

2.8.5 活性氧清除實驗

各組細胞干預48 h，按1∶800比例用無血清培養基稀釋DCFH-DA，去除細胞培養基，每孔加入100 μL稀釋好的DCFH-DA，置于37 ℃細胞培養箱內培養30 min，洗滌細胞3次，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。采用Image J軟件進行圖像分析，計算平均熒光強度。

2.8.6 RT-qPCR檢測相關靶點mRNA表達

各組細胞干預1、3、5 d，收集RNA，進行RT-qPCR，采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達量。引物購自鉑尚生物技術有限公司，各基因引物信息見表1。

表1 RT-qPCR各基因引物信息

2.8.7 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件進行分析，GraghPad9.0軟件進行繪圖。數據以表示，符合正態分布且方差齊的2組數據用非配對t檢驗，多組數據用方差分析，并采用Bonferroni法進行兩兩比較。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 生血補髓湯活性成分

生血補髓湯溶液正離子和負離子全掃描模式質譜圖見圖1。根據質譜檢測結果得到質譜碎片，將理論值與實測值進行比對（計算相對誤差），正、負離子模式下鑒別出46個活性成分，見表2。

表2 生血補髓湯化學成分鑒定

圖1 生血補髓湯溶液正離子和負離子全掃描模式質譜圖

3.2 生血補髓湯治療股骨頭壞死靶點

將篩選得到的活性成分按所屬藥物歸類，其中生地黃8個、白芍5個、川芎3個、當歸9個、杜仲9個、紅花8個、牛膝11個、黃芪17個、五加皮12個、續斷1個，合并、去重后獲得46個活性成分，得到預測靶點共732個。檢索獲得ONFH靶點1 386個。篩選得到生血補髓湯和ONFH靶點群中度值、介度值和緊密度均大于中位數的核心節點317個，其中二者交集靶點有48個，即為生血補髓湯治療ONFH靶點。

3.3 蛋白相互作用網絡

將48個交集靶點通過STRING數據庫構建靶蛋白PPI網絡，將結果導入Cytoscape3.7.2軟件，使用CytoNCA插件，以度值、介度值為參數進行分析。PPI網絡見圖2。度值和介度值排名前20位的靶點有甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、人內源性肌動蛋白（ACTB）、蛋白激酶1（AKT1）、轉錄因子AP-1（JUN）、胰島素基因（INS）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、雌激素受體1（ESR1）、腫瘤壞死因子（TNF）、HRas原癌基因（HRAS）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白細胞介素6（IL6）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、白細胞介素1β（IL-1β）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、糖原合成酶激酶3β（GSK3B）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、轉錄因子p65（RELA）、轉錄因子p50（NFKB1）、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α（PIK3CA）、雄激素受體（AR）。

圖2 生血補髓湯治療ONFH靶點PPI網絡

3.4 GO和KEGG通路富集分析結果

GO富集分析獲得生物過程（biological process，BP）條目共1 383個（P＜0.05），主要與炎癥反應、氧化應激和信號傳導過程等相關，前20個條目見圖3。KEGG通路富集分析得到相關通路共157條（P＜0.05），主要涉及TNF信號通路、IL-17信號通路、PI3K信號通路、HIF-1信號通路，前20條通路見圖4。

圖3 生血補髓湯治療ONFH靶點GO BP富集分析

圖4 生血補髓湯治療ONFH靶點KEGG通路富集分析

3.5 多維網絡關系

將48個交集靶點相關活性成分和藥物及主要KEGG通路導入Cytoscape3.7.2軟件，構建中藥-成分-靶點-通路多維網絡，見圖5。該網絡中包括9個藥物、26個活性成分節點、48個作用靶點及靶點富集的20條信號通路，共有478條邊。分析網絡拓撲參數，節點平均度值為13.31，節點度值排名前5位的活性成分是綠原酸、槲皮素、木犀草素、山柰酚、腺苷。

圖5 生血補髓湯治療ONFH中藥-成分-靶點-通路多維網絡

3.6 實驗驗證結果

3.6.1 單體復方濃度對RAW264.7細胞活力的影響

與RANKL組比較，RAW264.7細胞經低濃度、中濃度、高濃度生血補髓湯單體復方處理6、12、24 h，其活力無明顯變化（P＞0.05），見表3。選取高濃度單體復方作為后續實驗的干預濃度。

表3 各組不同時點RAW264.7細胞活力比較（，OD值）

表3 各組不同時點RAW264.7細胞活力比較（，OD值）

組別空白對照組RANKL組低濃度單體復方組中深度單體復方組高濃度單體復方組n 3 3 3 3 3 6 h 0.256±0.003 0.424±0.002 0.456±0.001 0.476±0.007 0.442±0.004 12 h 0.252±0.002 0.545±0.005 0.565±0.003 0.565±0.006 0.548±0.005 24 h 0.248±0.001 0.706±0.009 0.751±0.012 0.714±0.014 0.678±0.005

3.6.2 單體復方對RAW264.7細胞破骨分化的影響

RANKL組顯微鏡下可見多核細胞、單核細胞，其中破骨細胞體積較大，胞漿豐富、呈酒紅色，多核。與空白對照組比較，RANKL組TRAP陽性細胞數量顯著增加（P＜0.01）；與RANKL組比較，高濃度單體復方組陽性細胞數量明顯減少（P＜0.01）。見圖6、表4。

圖6 各組RAW264.7細胞破骨分化（TRAP染色，×40）

表4 各組RAW264.7細胞TRAP陽性數量比較（）

表4 各組RAW264.7細胞TRAP陽性數量比較（）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與RANKL組比較，**P＜0.01

TRAP+nuclei 0 452.7±19.7##55.7± 9.4**組別空白對照組RANKL組高濃度單體復方組n3 3 3

3.6.3 單體復方抑制RANKL誘導的活性氧活性

各組RAW264.7細胞干預48 h，用DCFH-DA熒光探針檢測細胞內ROS含量。與空白對照組比較，RANKL組細胞熒光強度明顯增強，表明RAW264.7細胞內產生大量ROS（P＜0.05）；與RANKL組比較，高濃度單體復方組細胞有少量熒光（P＜0.05），表明生血補髓湯單體復方可顯著抑制RAW264.7細胞內ROS的產生。見表5。

表5 各組RAW264.7細胞ROS含量比較（，熒光強度）

表5 各組RAW264.7細胞ROS含量比較（，熒光強度）

注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與RANKL組比較，*P＜0.05

ROS 11.82±0.86 21.72±2.21#12.84±0.96*組別空白對照組RANKL組高濃度單體復方組n 3 3 3

3.6.4 單體復方對RAW264.7細胞IL6、PTGS2、TNFα、RELAmRNA表達的影響

KEGG富集分析結果提示，TNF信號通路是富集程度最高且與生血補髓湯治療ONFH密切相關的通路，因此，選取該通路相關靶點IL6、PTGS2、TNFα、RELA，檢測其mRNA表達。分別于干預1、3、5 d檢測各組細胞IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達。干預1 d，與RANKL組比較，高濃度單體復方組RAW264.7細胞破骨分化中IL6 mRNA表達水平顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.01）；干預3 d，與RANKL組比較，高濃度單體復方組RAW264.7細胞破骨分化中IL6、TNFα mRNA表達水平顯著下調，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；干預5 d，與RANKL組比較，高濃度單體復方組RAW264.7細胞破骨分化中IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達水平顯著下調，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表6。

表6 各組RAW264.7細胞干預不同時點IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達比較（）

表6 各組RAW264.7細胞干預不同時點IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達比較（）

注：與RANKL組同時點比較，*P＜0.05，**P＜0.01

RELA 1.002±0.068 1.063±0.340 1.025±0.223 1.037±0.053 2.493±0.192 21.020±0.447 1.776±0.224 2.740±0.078 12.784±1.166**組別空白對照組RANKL組高濃度單體復方組時間1 d 3 d 5 d 1 d 3 d 5 d 1 d 3 d 5 d n 3 3 3 3 3 3 3 3 3 IL6 0.158±0.022 1.038±0.261 1.076±0.432 1.003±0.080 8.715±1.025 26.751±5.436 0.554±0.042**3.366±0.354*5.539±2.179*PTGS2 1.003±0.072 1.000±0.014 1.087±0.394 1.321±0.142 0.375±0.011 14.801±0.544 2.813±1.461 9.245±0.489**4.643±1.478**TNFα 1.015±0.166 1.002±0.060 1.008±0.129 1.525±0.087 8.751±0.544 5.607±0.411 0.926±0.203 0.380±0.024**3.252±0.467*

4 討論

依據臨床分期、病灶范圍和位置，ONFH可予髖關節置換術和保髖治療，保髖治療包括手術保髖和非手術保髖。中醫藥治療在預防股骨頭塌陷、壞死，延緩髖關節置換術的時間有獨特優勢，中國ONFH病例的中醫藥治療率達72%[23]。ONFH病理過程包括股骨頭發生缺血壞死，以及之后出現的壞死區的修復[24]。組織病理學研究結果顯示，壞死區骨組織骨小梁表面成骨細胞數量顯著減少、骨形成功能減弱，而破骨細胞數量異常增加、骨吸收功能增強[25-26]。在ONFH的早期階段可發現破骨細胞活性呈顯著增強狀態，若不加干預，隨著破骨細胞活性升高，其發展成晚期ONFH將極為迅速[27]。破骨細胞在分化成熟過程中會分泌大量炎性因子，升高骨髓微環境中炎癥水平，而這些炎性因子又可進一步促進破骨分化，炎性因子與破骨分化存在密切聯系[28-30]。在ONFH早期，炎性因子大量釋放，導致免疫細胞浸潤大血管區域，誘發血管區域的免疫炎性反應，繼續損害血管，加重病情[31-32]。

本研究基于UPLC-Q-TOF-MS技術分析生血補髓湯46種活性成分，并使用TCMIP2.0對鑒定的活性成分進行分析，找到生血補髓湯中關鍵成分如阿魏酸、綠原酸、芍藥苷、梓醇、槲皮素、山柰酚等。阿魏酸是當歸、川芎的主要活性成分[19]。吳建良等[33]發現阿魏酸能降低一氧化氮濃度，效果與藥物濃度呈正相關，可有效抑制炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α表達。綠原酸是刺五加、五加皮、紅毛五加皮的主要活性成分，具有抗氧化和抗炎特性[20-21]。綠原酸可通過清除細胞內ROS，抑制P-p38 MAPK磷酸化和上調NF-κB信號通路而抑制IL-8產生，從而起到抗炎作用[34]。芍藥苷是白芍的主要有效成分，其鎮痛作用可能與升高血清和大腦皮層中β-內啡肽水平、減少大腦皮層前列腺素E2（PGE2）生成或釋放有關[22，35]。梓醇是生地黃質量篩選的主要活性成分，在“成骨-破骨”共育體系中促進成骨細胞增殖，增強成骨細胞堿性磷酸酶活性，抑制破骨細胞活性，上調成骨細胞雌激素受體β mRNA表達[36-37]。槲皮素類黃酮成分包括槲皮素及山柰酚等，槲皮素類成分具有抗氧化、抗炎等藥理作用[38]。研究發現，山柰酚對脂多糖誘導的巨噬細胞RAW264.7中PGE2的產生有明顯抑制作用[39]。

根據活性成分對應的靶點進行分析，構建藥物-成分-靶點-通路多維網絡，對治療靶點進行GO和KEGG富集分析，得到生血補髓湯治療ONFH的信號通路，其中富集最顯著且與ONFH密切相關的是TNF信號通路，IL6、PTGS2、TNF、RELA是多維網絡中與該信號通路密切相關的靶點。炎性因子如IL-6、IL-4和TNF-α可能是ONFH疼痛癥狀的主要誘因，ONFH患者血清TNF-α和IL-6水平較健康志愿者偏高[31，40]。TNF-α在炎癥條件下直接或通過增加成骨細胞和基質細胞的RANKL和M-CSF表達刺激破骨細胞形成和激活[41]。研究發現，股骨頭壞死標志基因PTGS2主要參與炎癥免疫反應，這可能是疾病中期疼痛加重、功能受限的原因之一[42]。ROS是破骨細胞分化和形成的關鍵因素，抗氧化劑可以通過抑制ROS水平和抑制破骨細胞延緩ONFH進展[43]。Cheng等[44]研究發現，可以通過抑制PTGS2和PI3K-Akt途徑抑制ROS產生并發揮抑制破骨細胞活性的作用。RELA能夠阻斷RANKL誘導的JNK-Bid凋亡通路，從而促進破骨細胞分化[45]。TNF信號通路具有調節破骨細胞活性及骨吸收的作用，其中分離出的糖蛋白骨保護素（OPG）對骨形成也具有積極的保護作用[46]。而RANKL/RANK/OPG信號通路在調節骨重塑、破骨細胞分化和多種病理狀態過程中起著關鍵作用。由于其能夠調節成骨細胞和破骨細胞之間的平衡，以及骨髓間充質干細胞中成骨細胞和成脂的異常轉分化，因此被認為在ONFH的分子機制中起著核心作用[47]。

以上結果提示，生血補髓湯治療ONFH靶點主要與炎癥反應和氧化應激相關，相關靶點主要富集在炎癥相關信號通路，而炎癥反應是ONFH中晚期的典型表現。本研究采用RANKL誘導RAW264.7細胞破骨分化模型，并予生血補髓湯單體復方進行干預，同時檢測RAW264.7細胞破骨分化過程中ROS含量及IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達。結果顯示，生血補髓湯單體復方可顯著減少RANKL誘導RAW264.7細胞破骨分化中成熟破骨細胞數量、細胞漿內ROS含量及IL6、PTGS2、TNFα、RELA mRNA表達。

本研究通過UPLC-Q-TOF-MS技術對生血補髓湯中的活性成分進行快速、全面識別，可為進一步研究生血補髓湯干預ONFH及闡明生血補髓湯藥理作用提供依據；同時，基于TCMIP2.0使用網絡藥理學研究方法和細胞實驗驗證探究其治療ONFH的作用機制，可為后續研究提供指導。