溫陽益氣活血方對慢性心力衰竭大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的影響

呂李飛 ，魏孝欽 ，王夢歌 ，張賢儒 ，馬曉貞 ，多杰卓瑪 ，賈守寧 ，祁永福

1.青海大學，青海省糖脂代謝疾病防控中醫藥重點實驗室，青海 西寧 810016；2.青海省中醫院，青海 西寧 810012

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多種心臟疾病發展的終末階段，具有較高的發病率和病死率，目前常規西藥如沙庫巴曲纈沙坦鈉片、維利西呱，雖可穩定病情，但多數患者預后仍未達預期[1]。中醫治療慢性心系疾病經驗頗豐，根據臨床主要癥狀，CHF屬中醫學“心水”“怔忡”范疇，其基本病機為本虛標實，本虛為心之氣血陰陽虛衰，臟腑功能失調，標實為痰濁、水飲、氣滯、血瘀[2]。心氣虛是病理基礎，血瘀是中樞環節，水濕和痰飲是主要病理產物?；诖耍萎敎仃栆鏆饣钛?。溫陽益氣活血方由青海省中醫院多位名老中醫專家據芪附湯、桃仁紅花煎等古方化裁擬定，全方有溫陽益氣、活血化瘀之功。前期研究顯示，溫陽益氣活血方可通過Toll樣受體/核因子κB信號通路、AMPK信號通路及Th17細胞分化等途徑干預CHF，關鍵作用靶點有SMAD7、MYC、PCNA等[3]。

Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶主要位于心肌細胞膜和線粒體膜上，二者表達水平可反映心肌細胞功能的完整性。當CHF發生時，心肌纖維過度收縮，打破心肌細胞內正常的氧化還原狀態，引發物質與能量代謝異常，最終造成機體穩態失衡。因此，整合ATP酶表達與CHF病理變化的復雜調控網絡，能發現并闡明CHF發病的能量代謝機制。本研究以CHF模型大鼠為研究對象，觀察溫陽益氣活血方對模型大鼠心肌Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶表達的影響，從能量代謝角度闡釋其治療CHF的作用機制，為中醫治療CHF提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠90只，6周齡，體質量（200±20）g，西安交通大學醫學部實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK（陜）2018-001。飼養于青海大學醫學院動物房，動物使用許可證號SYXK（青）2020-0001，溫度23～25 ℃，濕度55%～70%，12 h光暗循環，適應性飼養1周后開始實驗。本實驗經青海省中醫院倫理委員會審批（qhszyy1103201901）。

1.2 藥物

溫陽益氣活血方（人參15 g，黃芪20 g，桂枝10 g，附子10 g，熟地黃12 g，當歸 10g，白芍15 g，赤芍16 g，川芎10 g，桃仁10 g，紅花10 g），飲片顆粒購于青海省中醫院，按原藥材用量計算后將顆粒混勻，加入純凈水溶解，配制成濃度分別為0.81、0.405、0.202 5 g/mL混懸液。鹽酸異丙腎上腺素，上海源葉生物科技有限公司，貨號S31064?？ㄍ衅绽?，山西津華暉星制藥有限公司，25 mg/片，批號200120。氫氯噻嗪片，天津力生制藥有限公司，25 mg/片，批號2005008。螺內酯片，國藥集團武漢中聯四藥藥業有限公司，20 mg/片，批號200904。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠腦鈉肽（BNP）ELISA試劑盒（貨號E-ELR0126c）、Na+-K+-ATP酶比色法試劑盒（貨號E-BCK539-M）、Ca2+-ATP酶比色法試劑盒（貨號E-BCK212-M），武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；Servicebio?RT第一鏈cDNA合成試劑盒（貨號G3330）、2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX）（貨號G3322）、Ca2+-ATP酶兔多克隆抗體（貨號GB112371）、Na+-K+-ATP酶兔多克隆抗體（貨號GB11400-1），武漢賽維爾生物科技有限公司；異氟烷（貨號R510-22），瑞沃德生命科技有限公司。

Thermomixer C恒溫混勻儀，德國艾本德股份公司；QL901漩渦振蕩器，海門其林貝爾有限公司；ECLIPSE Ci-L正置白光拍照顯微鏡、E100顯微鏡、Nikon DS-U3成像系統，日本尼康公司；Pannoramic DESK全景切片掃描儀，匈牙利3DHISTECH公司；ZS3 Exp型小動物彩色多普勒超聲儀，中國邁瑞公司；Illumina HiSeq/MiSeq PE250測序儀，美國因美納公司；Chemray 800全自動生化分析儀，深圳雷杜生命科技有限公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀、NanoDrop2000超微量分光光度計，賽默飛科技有限公司；H1650-W臺式微量高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Epoch多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；R500IE小動物麻醉機，瑞沃德生命科技有限公司。

1.4 造模

90只大鼠按隨機數字表法分為空白組15只、實驗組75只，實驗組采用4 mg/mL異丙腎上腺素皮下多點注射10 mg/kg誘導CHF模型，空白組注射等量生理鹽水，連續14 d。造模期間觀察并記錄大鼠一般情況。造模結束后次日對所有大鼠行超聲檢測，檢測前禁食水12 h，參考文獻[4-5]標準，左室射血分數（LVEF）＜60%表明CHF模型造模成功。

1.5 分組及干預

剔除死亡及未成模大鼠5只，將70只成模大鼠隨機分為模型組、西藥組和溫陽益氣活血方低、中、高劑量組（中藥低、中、高劑量組），每組14只。參照人與動物體表面積折算的等效劑量換算大鼠給藥量，中藥高、中、低劑量組分別予溫陽益氣活血方混懸液8.1、4.05、2.025 g/kg灌胃（相當于臨床成人用藥劑量的2、1、1/2倍），西藥組予卡托普利片5.3 mg/kg+氫氯噻嗪片2.6 mg/kg+螺內酯片2.6 mg/kg灌胃，空白組和模型組予等量生理鹽水，灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續6周。

1.6 一般狀況觀察

實驗過程中觀察大鼠毛色、精神及飲食情況。

不一會兒周所長來到，陪著秦明月在廣場轉了一圈，秦明月說：“到達火車站共有三種方式，一是搭乘私家車或者租車；二是打的；三是乘公交車從廣場東面步行過來。”

1.7 心臟超聲檢查

造模及給藥結束后，脫毛膏去除大鼠左胸部毛發，異氟烷麻醉，彩色多普勒超聲儀測量LVEF、左室收縮末期內徑（LVESD）、左室舒張末期內徑（LVEDD），連續測量3個心動周期，取平均值，計算左室短軸縮短率（LVFS）。LVFS（%）=（LVEDD-LVESD）÷LVEDD×100%。實驗由同一名影像醫師完成，操作過程中遵循盲法原則。

1.8 血清腦鈉肽檢測

末次給藥后禁食不禁水12 h，次日20%烏來糖0.8 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定于手術臺上，腹主動脈采血，常溫靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，取上層血清，按ELISA試劑盒操作步驟檢測BNP含量。

1.9 心臟質量指數計算

末次給藥前稱量大鼠體質量，腹主動脈采血后分離大鼠心臟，預冷生理鹽水沖洗，無菌紗布吸干水分，稱量心臟質量，計算心臟質量指數（HMI，心臟質量/體質量）。

1.10 HE染色

取心肌組織，生理鹽水沖洗，置于4%多聚甲醛溶液中固定，修剪，脫水，浸蠟，包埋，切片，行HE染色，封片，顯微鏡下觀察心肌組織病理改變。

1.11 Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性檢測

取心肌組織，按質量/體積比為1∶9加入預冷生理鹽水，充分勻漿，調整樣本檢測濃度，采用比色法試劑盒檢測心肌Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.12 RT-PCR檢測

取心肌組織0.1 g，充分剪碎后置于勻漿管，加入Trizol，研磨儀充分研磨，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，加入250 μL三氯甲烷，顛倒混勻后，常溫靜置3 min，12 000 r/min離心10 min，吸取400 μL上清液置新EP管中，加入0.8倍體積異丙醇混勻，-20 ℃靜置15 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，用75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀干燥后，加入無酶水15 μL，55 ℃孵育5 min，采用NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA濃度及純度。根據Servicebio?RT Enzyme Mix試劑盒說明書將RNA進行反轉錄合成cDNA，按2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明書配制反應體系。反應條件：95 ℃預變性 10 min，95 ℃、15 s→60 ℃、30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.13 免疫組織染色

心臟組織修剪后石蠟包埋，制成3 μm切片，60 ℃烘烤2 h，經二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟及梯度酒精水化，熱修復抗原，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉后，加Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶一抗（1∶1 000），濕盒內4 ℃孵育過夜。加入二抗，室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木素復染3 min，脫水封片。顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達，采用Aipathwell軟件分析細胞陽性表達率（陽性細胞數÷細胞總數×100%）。

1.14 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。符合正態分布數據以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，方差不齊用校正t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane” s T2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 溫陽益氣活血方對模型大鼠一般狀況的影響

模型組大鼠扎堆，活動少，體質量減輕，食少，毛發凌亂、黃脆易掉，胞瞼下垂，無神呆滯，舌色瘀點，唇黯爪青，陰囊脫出，尿少，超聲備皮前可見頸部青筋暴露，抓捕時易見甲掉出血，甚則全胸部觸之如石、滿胸積液，以上癥狀與CHF相符[6]。相應藥物干預后，西藥組及中藥各劑量組大鼠一般情況均較模型組減輕，脫毛癥狀緩解，體質量、飲食量和活動量增加，中藥高劑量組毛色光澤度優于其他給藥組。

2.2 溫陽益氣活血方對模型大鼠心臟超聲指標的影響

與空白組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥各劑量組大鼠LVEF、LVFS顯著升高（P＜0.01）；與西藥組比較，中藥高劑量組大鼠LVEF、LVFS顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心臟超聲指標比較（，%）

表2 各組大鼠心臟超聲指標比較（，%）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.05

LVFS 65.25±3.05 36.82±2.65**45.19±3.18##45.84±3.33##45.92±5.66##48.86±4.39##▲組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數11 12 10 7 8 1 1 LVEF 88.28±3.35 51.28±5.81**72.01±5.02##75.43±7.60##75.76±6.71##77.79±6.14##▲

2.3 溫陽益氣活血方對模型大鼠血清腦鈉肽含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清BNP含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥高劑量組大鼠血清BNP含量顯著減少（P＜0.05）；與中藥高劑量組比較，中藥低、中劑量組BNP含量顯著增加（P＜0.01）。中藥高劑量組與西藥組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清BNP含量比較（，pg/mL）

表3 各組大鼠血清BNP含量比較（，pg/mL）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與中藥高劑量組比較，▲▲P＜0.01

BNP 71.49± 9.86 452.61±90.22**174.76±14.24#298.84±20.68▲▲281.64±19.02▲▲167.87±12.33#組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數5 5 5 5 5 5

2.4 溫陽益氣活血方對模型大鼠心臟質量指數的影響

與空白組比較，模型組大鼠HMI顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組及中藥各劑量組大鼠HMI顯著降低（P＜0.01），中藥高劑量組大鼠HMI降低最明顯（P＜0.01）；與西藥組比較，中藥低、中劑量組大鼠HMI顯著升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠HMI比較（，mg/g）

表4 各組大鼠HMI比較（，mg/g）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與西藥組比較，△△P＜0.01；與中藥高劑量組比較，▲▲P＜0.01

HMI 2.26±0.12 2.84±0.09**2.37±0.03##2.72±0.10##△△▲▲2.65±0.07##△△▲▲2.36±0.03##組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數11 12 10 7 8 1 1

2.5 溫陽益氣活血方對模型大鼠心肌組織病理變化的影響

空白組大鼠心肌纖維結構正常、分界清晰、排列規則，間質未見明顯異常，無炎癥浸潤；模型組大鼠心肌組織大量纖維水腫，胞質疏松淡染，少量心肌細胞空泡變性，胞質內可見微小圓形空泡，組織邊緣可見心肌纖維溶解，被增生的結締組織取代，伴有少量淋巴細胞浸潤；西藥組可見少量心肌細胞空泡變性，胞質內有微小圓形空泡，心肌細胞腫脹，胞質疏松淡染，間質伴有少量結締組織增生，并可見少量血管淤血擴張；中藥各劑量組大鼠心肌細胞空泡變性減少，胞質內可見微小圓形空泡，纖維水腫、胞質疏松、炎癥浸潤及纖維溶解程度較模型組有所改善，以中藥高劑量組改善最明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態（HE染色，×200）

2.6 溫陽益氣活血方對模型大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥各劑量組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性顯著升高（P＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性比較（）

表5 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性比較（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別Ca2+-ATP酶/（U/kg）只數Na+-K+-ATP酶/（μmol/mg）空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組74.32±0.84 41.47±2.68**60.68±1.93##54.00±3.16##55.95±3.01##60.96±3.83##3 3 3 3 3 3 72.09±1.28 43.70±4.60**60.40±2.55##54.28±2.51##57.90±5.03##62.91±3.37##

2.7 溫陽益氣活血方對模型大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥中、高劑量組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶mRNA表達顯著升高（P＜0.01）。見表6。

表6 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶mRNA表達比較（）

表6 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶mRNA表達比較（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

Ca2+-ATP酶1.32±0.04 0.59±0.10**1.04±0.07##0.74±0.08 0.82±0.05##1.06±0.15##組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數3 3 3 3 3 3 Na+-K+-ATP酶1.29±0.12 0.51±0.11**1.08±0.09##0.78±0.02##0.85±0.03##1.12±0.12##

2.8 溫陽益氣活血方對模型大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶陽性表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥各劑量組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶陽性表達顯著升高（P＜0.01）。見表7、圖2、圖3。

圖2 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶陽性表達（免疫組化染色）

圖3 各組大鼠心肌組織Ca2+-ATP酶陽性表達（免疫組化染色）

表7 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶陽性表達比較（，%）

表7 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶陽性表達比較（，%）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

Ca2+-ATP酶0.96±0.03 0.37±0.07**0.76±0.08##0.54±0.06##0.65±0.02##0.81±0.06##組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數3 3 3 3 3 3 Na+-K+-ATP酶0.89±0.04 0.30±0.03**0.69±0.04##0.49±0.05##0.63±0.04##0.75±0.03##

3 討論

本實驗采用皮下注射異丙腎上腺素制備CHF模型，可以模擬CHF神經過度激活，造模方法簡便價廉，但由于異丙腎上腺素注射后對心臟產生嚴重的毒性和強興奮性，且對心肌損害是一個慢性、蓄積性過程，因此可見造模大鼠精神萎靡、少倦懶動、進食減少、皮毛枯槁等癥狀，2周后開始出現死亡。與空白組比較，模型組大鼠心功能（LVEF、LVFS）顯著下降，血清BNP含量顯著增加，表明CHF模型造模成功。

BNP主要由心室細胞分泌，病理狀態下，其代償分泌增加，因此可作為評價心臟負荷的主要指標[7]。HMI能相對準確地反映左心室功能不全程度，CHF發生時，左室出現心肌肥厚，使心臟顯著擴大。本研究結果顯示，各給藥組大鼠BNP、HMI較模型組減少，表明溫陽益氣活血方能改善模型大鼠的心功能不全癥狀。

Ca2+-ATP酶又稱鈣泵，約2/3的Ca2+運轉由心肌肌漿網鈣泵（SERCA）主導并參與[8]，SERCA功能正常對維持心肌活動穩定有重要作用。Na+-K+-ATP酶又稱鈉泵或Na+-K+-依賴式ATP酶，是一種廣泛分布于細胞膜上的特殊糖蛋白，對心肌細胞的生理穩態至關重要。2種ATP酶能完成心肌正常的Na+-K+、Na+-Ca2+交換，避免Ca2+超載和心肌舒張遲緩的發生，在一定程度上抑制神經-體液調節系統，減輕心臟負荷，穩定心率及心肌收縮[9-10]。但CHF由代償期轉向失代償期時，會伴隨心肌細胞炎癥反應、心肌細胞非程序性死亡、心室重構等，這一轉折期的關鍵機制可由氧化應激介導，心肌病理損傷后能釋放大量ATP，其中一部分可用于激活氧化應激反應，加速促炎因子、氧化應激產物、炎性轉錄因子表達，而另一部分能觸發NLRP3炎癥小體，介導心肌細胞焦亡[11-12]。當ATP酶表達受阻時，相應的酶活性下降，進而響應細胞膜內的高Na+反應，迫使Ca2+內流，導致膜電位失衡，誘導心肌Ca2+超載損傷。線粒體能量代謝紊亂是CHF心肌肥厚的重要機制，心肌損傷后，線粒體產能降低及氧化反應失衡，誘導Ca2+超負荷和活性氧生成增加，產生細胞毒性，進而導致心肌細胞功能不全，引發心肌結構和能量代謝重構[13-16]。本實驗研究發現，CHF心功能不全涉及能量代謝失衡，模型組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性降低，mRNA和蛋白表達也降低，經溫陽益氣活血方干預后，各中藥組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性、mRNA和蛋白表達均有不同程度升高，推測可能是溫陽益氣活血方治療CHF的機制之一。

溫陽益氣活血方以桂枝、附子為君，附子溫走三焦，既能引火歸元，又助桂枝入血分活血通滯；人參、黃芪、熟地黃為臣，人參不僅善培補元氣，且能扶正祛邪，配伍黃芪共治氣虛之證，且黃芪又可養血利水行滯，助桂枝、附子益氣化瘀，熟地黃填補精髓，為助陽化氣提供物質基礎；當歸補血行血，白芍養血柔肝，使肝氣調暢，且兼酸甘化陰血之性，川芎活血行氣，氣行則血行，同白芍相配，無行傷耗血之虞，三藥共為佐藥；桃仁、紅花、赤芍為使，桃仁性平，行血卻不過極，同時佐助當歸行潤腸通便之功，紅花、赤芍溫涼適宜，互相制約，共奏活血之效。

綜上所述，溫陽益氣活血方能改善CHF心功能不全，其機制與增強Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，上調其mRNA及蛋白表達，改善CHF能量代謝失調有關。后續課題組將從能量代謝角度進一步探究CHF的發病機制，篩選溫陽益氣活血方干預CHF的有效作用靶點，為臨床CHF療效評估及中醫診治提供實驗依據。