基于miR-34a-5p/SIRT1通路探討壯醫(yī)藥線點灸治療偏頭痛模型大鼠的作用機制

范小婷 ，沈小淞 ，施學麗 ，劉姣 ，梁弘 ，趙明陽 ，林辰

1.廣西中醫(yī)藥大學壯醫(yī)藥學院，廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3.廣西中醫(yī)藥大學研究生院，廣西 南寧 530001

偏頭痛是一種以頭部疼痛為主癥，伴發(fā)惡心、嘔吐等自主神經功能障礙的慢性神經血管性疾病[1]。有文獻報道，按失能所致生命年損失計算，偏頭痛為我國第5位致殘性疾病，其高發(fā)病率及致殘率對患者生活質量造成巨大影響[2]。現代醫(yī)學治療偏頭痛多以緩解疼痛為主，但所用藥物對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等有一定不良反應[3]。壯醫(yī)藥線點灸具有降低炎癥、提高機體免疫功能作用[4-5]，對偏頭痛防治有獨特優(yōu)勢[6]。三叉神經血管系統(tǒng)（TGVS）激活引起的神經源性炎癥反應是偏頭痛發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)[7]，miR-34a與炎癥反應關系密切，其高表達可促進炎癥發(fā)展[8]。沉默信息調節(jié)因子（SIRT）1是組蛋白修飾的去乙酰化酶，通過去乙酰化核因子（NF）-κB發(fā)揮抗炎作用[9]，是miR-34a的靶基因[10]。研究發(fā)現，miR-34a-5p/SIRT1通路介導偏頭痛發(fā)病過程，調控miR-34a-5p/SIRT1通路，抑制乙酰化NF-κB p65（Ac-NF-κB p65）表達可緩解大鼠偏頭痛[11]。壯醫(yī)藥線點灸能調控SIRT1/NF-κB通路[12]。本研究以硝酸甘油誘導偏頭痛模型大鼠為研究對象，觀察壯醫(yī)藥線點灸對腦組織miR-34a-5p/SIRT1信號通路的影響，揭示其治療偏頭痛的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雄性SD大鼠40只，體質量（200±25）g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0014。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心清潔級動物房，室溫（23±2）℃，濕度50%～65%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。本實驗相關操作均按照《關于善待實驗動物的指導性意見》有關規(guī)定進行，并通過廣西中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理委員會審批（DW20211224-222）。

1.2 主要試劑與儀器

硝酸甘油注射液（山西康寶生物制品股份有限公司，批號200707L2641），SIRT1抑制劑EX-527（美國Selleck，批號S1541），降鈣素基因相關肽（CGRP）、NF-κB、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA Kit（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號均為20220410），RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號20220310），SIRT1抗體（北京索萊寶科技有限公司，批號20220413），Ac-NF-κB p65抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號AF3795），NF-κB p65抗體、TNF-α抗體（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號20211210、20210910），反轉錄試劑盒、熒光定量mix（武漢莫納生物科技有限公司，批號140609、140450），TUNEL試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號MPC2103014）。酶標分析儀（南京德鐵，型號HBS-1096A），低溫離心機（德國Eppendorf，型號5418R），多功能酶標儀（美國MD，型號FilterMax F3），蛋白轉印模塊（美國Bio-Rad，型號Mini Trans-Blot Cell），凝膠成像系統(tǒng)（上海碧云天生物技術有限公司，型號EI600C），熒光定量PCR儀（瑞士Roche，型號Light Cycler?96），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016），石蠟包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號JB-P5），顯微鏡、成像系統(tǒng)（日本尼康，型號E100、DS-U3）。

1.3 分組及造模

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組、模型對照組、點灸組、點灸+EX-527組和點灸+生理鹽水組，每組8只。參考文獻[13-14]建立偏頭痛大鼠模型，分別于第1、5、9、13、14日頸部皮下注射硝酸甘油注射液10 mg/kg，空白對照組注射0.9%氯化鈉注射液10 mg/kg，共5次。大鼠注射后出現前肢頻繁撓頭、雙耳發(fā)紅、咬尾、爬籠次數增多、往返運動增多、煩躁不安等行為提示造模成功[15-16]。

1.4 干預

第1日造模成功30 min后開始干預，點灸組、點灸+EX-527組和點灸+生理鹽水組選取大鼠“合谷”（雙）、“太沖”（雙）和“臍環(huán)穴”[17-19]，臍環(huán)穴3穴、6穴、9穴、12穴分別位于肚臍正左方、正下方、正右方和正上方（旁開2.5 mm）。將大鼠固定于特制鼠板，剃除穴位處毛發(fā)，將壯醫(yī)藥線（直徑0.7 mm）點燃，待火候形成珠火，立刻用輕手法施灸于穴位上，火滅即起為1壯，每穴點灸2壯，每日1次，連續(xù)14 d；點灸+EX-527組于點灸后腹腔注射EX-527（5 mg/kg）[20]；點灸+生理鹽水組于點灸后腹腔注射生理鹽水（5 mg/kg）。空白對照組和模型對照組僅固定，不干預。

1.5 取材

第14日對大鼠進行行為學評分后，2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，快速腹主動脈采血5 mL，3 000 r/min離心10 min，收集血清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒋笫髷囝^處死，冰上分離中腦導水管周圍灰質區(qū)，沿矢狀位平均分成2部分：一部分于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot、qPCR檢測；另一部分用4%多聚甲醛固定后，制作石蠟切片，用于HE染色和TUNEL染色。

1.6 指標檢測

1.6.1 行為學評分

第14日干預后對大鼠進行行為學評分[21]。記錄各組大鼠撓頭、咬尾、爬籠、往返運動次數，每個行為出現1次計1分。

1.6.2 ELISA檢測

根據ELISA試劑盒說明書進行操作，測定各組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量。

1.6.3 qPCR檢測

取中腦組織20 mg加入1 mL Trizol，低溫研磨機研磨，加入氯仿200 μL漩渦震蕩30 s，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，沉淀、干燥RNA后，DEPC水溶解，酶標儀測定濃度和純度。配制反轉錄體系，反轉錄得到cDNA，用cDNA作為擴增模板，配制20 μL PCR體系。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6.4 Western blot檢測

取中腦組織剪碎，每20 mg組織加入200 μL裂解液，低溫高速組織研磨儀研磨，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度。快速凝膠制備試劑盒制膠，加樣，電泳，轉膜，PVDF膜放入快速封閉液中封閉30 min，分別置于SIRT1一抗（1∶1 000）、Ac-NF-κB p65一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶2 000）、TNF-α一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶2 000）中，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，將膜放入HRP標記山羊抗兔二抗（1∶10 000）中，37 ℃搖床孵育1 h。TBST洗膜，ECL超敏化學發(fā)光液浸泡，凝膠成像系統(tǒng)顯色，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6.5 HE染色

石蠟切片65 ℃烤片2 h，脫蠟至水，滴加蘇木素染液染色5 min，自來水浸泡，分化，返藍，水洗，滴加伊紅染液染色5 min，無水乙醇脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察中腦組織病理變化。

1.6.6 TUNEL染色

根據凋亡試劑盒說明書進行TUNEL染色，光學顯微鏡下采集圖像，細胞核棕黃色代表凋亡細胞，每張切片隨機選取5個不重疊視野，用CMIAS圖像分析系統(tǒng)計算凋亡細胞數。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 壯醫(yī)藥線點灸對模型大鼠行為學評分的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠行為學評分明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，點灸組、點灸+EX-527組和點灸+生理鹽水組大鼠行為學評分明顯降低（P＜0.05）；與點灸組比較，點灸+EX-527組大鼠行為學評分明顯升高（P＜0.05）；與點灸+EX-527組比較，點灸組+生理鹽水組大鼠行為學評分明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠行為學評分比較（，分）

表2 各組大鼠行為學評分比較（，分）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05；與點灸組比較，△P＜0.05；與點灸+EX-527組比較，&P＜0.05

評分組別 只數12.13±1.64 43.88±4.19**27.63±2.39#33.25±3.28#△27.50±3.38#&空白對照組模型對照組點灸組點灸+EX-527組點灸+生理鹽水組8 8 8 8 8

2.2 壯醫(yī)藥線點灸對模型大鼠血清降鈣素基因相關肽、核因子-κB、腫瘤壞死因子α含量的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量明顯增加（P＜0.01）；與模型對照組比較，點灸組、點灸+EX-527組和點灸+生理鹽水組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量明顯減少（P＜0.05）；與點灸組比較，點灸+EX-527組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量明顯增加（P＜0.05）；與點灸+EX-527組比較，點灸組+生理鹽水組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α 含量明顯減少（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量比較（）

表3 各組大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量比較（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05；與點灸組比較，△P＜0.05；與點灸+EX-527組比較，&P＜0.05

組別TNF-α/（pg/mL）只數CGRP/（pg/mL）NF-κB/（μmol/L）空白對照組模型對照組點灸組點灸+EX-527組點灸+生理鹽水組54.01± 9.01 151.14±21.58**85.06± 9.09#104.15±17.26#△89.21± 8.25#&8 8 8 8 8 104.87±12.45 248.02±22.84**151.65±12.81#194.69±28.75#△149.69±18.68#&32.54± 4.55 93.66±11.30**51.69± 6.53#66.29± 8.40#△47.83± 4.96#&

2.3 壯醫(yī)藥線點灸對模型大鼠中腦組織miR-34a-5p、沉默信息調節(jié)因子1、核因子-κB p65 mRNA表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠中腦組織miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表達升高（P＜0.01），SIRT1 mRNA表達降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，點灸組、點灸+EX-527組和點灸+生理鹽水組大鼠中腦組織miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表達降低（P＜0.05），SIRT1 mRNA表達升高（P＜0.05）；與點灸組比較，點灸+EX-527組大鼠中腦組織miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表達升高（P＜0.05），SIRT1 mRNA表達降低（P＜0.05）；與點灸+EX-527組比較，點灸組+生理鹽水組大鼠中腦組織miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表達降低（P＜0.05），SIRT1 mRNA表達升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠中腦組織miR-34a-5p、SIRT1、NF-κB p65 mRNA表達比較（）

表4 各組大鼠中腦組織miR-34a-5p、SIRT1、NF-κB p65 mRNA表達比較（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05；與點灸組比較，△P＜0.05；與點灸+EX-527組比較，&P＜0.05

組別空白對照組模型對照組點灸組點灸+EX-527組點灸+生理鹽水組NF-κB p65 1.01±0.16 2.11±0.23**1.25±0.13#1.55±0.16#△1.30±0.14#&只數8 8 8 8 8 miR-34a-5p 1.01±0.11 1.89±0.24**1.32±0.15#1.63±0.17#△1.33±0.12#&SIRT1 1.01±0.14 0.37±0.05**0.76±0.12#0.62±0.08#△0.74±0.10#&

2.4 壯醫(yī)藥線點灸對模型大鼠中腦組織沉默信息調節(jié)因子1、乙酰化-核因子-κB p65、核因子-κB p65、腫瘤壞死因子α蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠中腦組織SIRT1蛋白表達降低（P＜0.01），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，點灸組、點灸+EX-527組和點灸+生理鹽水組大鼠中腦組織SIRT1蛋白表達升高（P＜0.05），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白表達降低（P＜0.05）；與點灸組比較，點灸+EX-527組大鼠中腦組織SIRT1蛋白表達降低（P＜0.05），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白表達升高（P＜0.05）；與點灸+EX-527組比較，點灸+生理鹽水組大鼠中腦組織SIRT1蛋白表達升高（P＜0.05），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和 TNF-α 蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖1、表5。

圖1 各組大鼠中腦組織SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠中腦組織SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α蛋白表達比較（）

表5 各組大鼠中腦組織SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α蛋白表達比較（）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05；與點灸組比較，△P＜0.05；與點灸+EX-527組比較，&P＜0.05

組別空白對照組模型對照組點灸組點灸+EX-527組點灸+生理鹽水組0.46±0.06 0.92±0.11**0.59±0.07#0.75±0.09#△0.60±0.09#&8 8 8 8 8 1.10±0.11 0.49±0.07**0.84±0.10#0.67±0.07#△0.85±0.10#&0.38±0.07 0.86±0.09**0.57±0.07#0.71±0.08#△0.54±0.06#&0.46±0.06 1.15±0.13**0.65±0.09#0.86±0.10#△0.64±0.08#&TNF-α只數SIRT1Ac-NF-κB p65NF-κB p65

2.5 壯醫(yī)藥線點灸對模型大鼠中腦組織病理變化的影響

空白對照組大鼠中腦組織染色均勻，神經細胞排列緊密、整齊，邊緣清晰，未見明顯細胞腫脹、壞死等病理改變及炎癥細胞浸潤；模型對照組大鼠中腦組織未見明顯細胞腫脹、壞死等病理改變和炎癥細胞浸潤；點灸組、點灸+EX-527組和點灸+生理鹽水組大鼠中腦組織均未出現明顯變化。總體上，各組大鼠中腦組織HE染色均未發(fā)現明顯器質性病變，未見明顯水腫、壞死等。見圖2。

圖2 各組大鼠中腦組織形態(tài)（HE染色，×400）

2.6 壯醫(yī)藥線點灸對模型大鼠中腦組織細胞凋亡的影響

各組大鼠中腦組織神經細胞均未見胞體縮小及胞核固縮，無明顯細胞凋亡，胞核染色均勻，形態(tài)正常。見圖3。

圖3 各組大鼠中腦組織細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×400）

3 討論

壯醫(yī)藥線點灸是國家級非物質文化遺產，具有祛毒通絡、調氣止痛等功效，且無不良反應。臨床應用壯醫(yī)藥線點灸治療偏頭痛效果滿意[22]。壯醫(yī)學認為，偏頭痛發(fā)病主要與外來毒邪或內生毒邪阻滯“巧塢”（大腦）之龍路、火路，致機體三道兩路不暢，氣血失衡，天、地、人三氣不能同步運行，終致“巧塢”道路網絡不通或失養(yǎng)相關[23]。因此，治療以通路止痛、均衡氣血，復歸天、地、人三氣同步運行為要。壯醫(yī)將肚臍比作“命蒂”，不僅能溝通五臟六腑與先天、后天，還與人整體相通應。且臍部位于人體中央，聚集天、地、人三部之精華，可承上啟下，是氣血運行之樞紐，與人體天氣之下降、地氣之上升、人氣之調和密切相關。壯醫(yī)藥線點灸臍環(huán)穴（3穴、6穴、9穴、12穴）不僅能暢通道路，調整機體氣機，還可溝通先天與后天，鼓舞正氣，祛邪外出，從而恢復機體氣血均衡、三氣同步的自然狀態(tài)，實現鎮(zhèn)靜安神止痛。從現代醫(yī)學角度分析，刺激臍環(huán)穴可能通過神經、體液而調節(jié)神經、內分泌和免疫系統(tǒng)，從而改善各組織器官的功能活動[19]。合谷可行氣通降，開竅鎮(zhèn)靜止痛以安神；太沖善于理氣止痛，調和氣血以安神。文獻報道，針灸合谷、太沖可調控NF-κB信號通路，改善大腦動脈血流速度及偏頭痛癥狀[24]。

硝酸甘油制備偏頭痛模型已得到認可[25]，其在體內產生一氧化氮同時作用于血管和神經元，一方面通過強烈的擴血管作用，在血管周圍產生無菌性炎癥；另一方面通過激活TGVS，激活神經源性炎癥反應產生CGRP等，進一步引發(fā)偏頭痛[26]。而CGRP釋放入血是TGVS激活的重要環(huán)節(jié)，是引發(fā)偏頭痛的重要因子[27]。本研究中，大鼠造模后出現行為學改變，與空白對照組比較，模型對照組大鼠行為學評分升高，且血清炎癥因子TNF-α、NF-κB含量和舒血管神經肽CGRP含量增加，提示偏頭痛模型造模成功。TNF-α、NF-κB、CGRP均參與偏頭痛發(fā)生，TGVS被激活，處于炎癥反應狀態(tài)。干預后，點灸組、點灸+EX-527組和點灸+生理鹽水組大鼠行為學評分均顯著降低，血清TNF-α、NF-κB、CGRP含量減少，提示壯醫(yī)藥線點灸治療可以抑制炎癥因子NF-κB、TNF-α分泌，減少舒血管神經肽CGRP釋放，有效調控偏頭痛模型大鼠神經源性炎癥反應，抑制神經血管擴張。有文獻指出，TGVS存在炎癥因子-CGRP-血管舒縮異常正反饋環(huán)路，進一步加強炎癥反應和血管擴張，維持偏頭痛持續(xù)狀態(tài)[28]。由此，本研究中模型大鼠血清CGRP含量增加可能與炎癥因子TNF-α含量增加相關，TGVS中炎癥因子-CGRP-血管舒縮異常正反饋環(huán)路被激活，炎癥因子TNF-α誘導CGRP釋放，且存在惡性循環(huán)，而壯醫(yī)藥線點灸可以調控炎癥因子-CGRP-血管舒縮異常環(huán)路，抑制炎癥因子TNF-α合成與表達，從而拮抗CGRP。

miRNA是一類非編碼單鏈RNAs，具有調控靶基因表達作用。目前已發(fā)現一些miRNAs與炎癥反應[29]、慢性疼痛[30]等相關，其中miR-34a-5p與偏頭痛發(fā)作相關[31]。靜息狀態(tài)下，NF-κB（p50、p65等亞單位）通常與其抑制因子以異源二聚體形式存在于細胞質中[32]，當機體受到炎癥等信號刺激時，NF-κB被激活，快速移位進入細胞核并大量轉錄，促使下游炎癥因子分泌[33]，從而參與炎癥反應[34]。SIRT1是一種去乙酰化酶，也參與偏頭痛病理過程[35]。SIRT1可直接作用于NF-κB p65，通過去乙酰化作用降低Ac-NF-κB p65水平，抑制機體炎癥反應，調控下游炎癥因子轉錄，進而改善炎癥癥狀[36]。本研究發(fā)現，模型組大鼠中腦組織miR-34a-5p表達升高，SIRT1基因與蛋白表達降低，Ac-NF-κB p65、TNF-α蛋白及NF-κB p65基因和蛋白表達升高，提示miR-34a-5p能抑制SIRT1表達，導致SIRT1去乙酰化能力降低，NF-κB p65乙酰化，誘發(fā)NF-κB核移位，激活其介導的炎癥信號通路，從而釋放大量炎癥因子。經壯醫(yī)藥線點灸干預后，miR-34a-5p表達降低，SIRT1基因和蛋白表達升高，Ac-NF-κB p65、TNF-α蛋白及NF-κB p65基因和蛋白表達降低，提示壯醫(yī)藥線點灸可通過抑制miR-34a-5p表達，促進SIRT1轉錄，提高其去乙酰化能力，抑制NF-κB激活，進而抑制下游炎癥因子釋放。注射SIRT1抑制劑EX-527后，出現拮抗壯醫(yī)藥線點灸的抗炎效應，而點灸+生理鹽水組并未出現此種拮抗效果，進一步提示壯醫(yī)藥線點灸可通過上調SIRT1表達抑制炎癥信號通路。

在本研究中模型對照組大鼠雖處于炎癥狀態(tài)，而中腦未出現組織形態(tài)改變和細胞凋亡，推測可能是在炎癥早期，炎性細胞雖釋放炎癥因子，但炎癥反應尚未達到引發(fā)炎性細胞浸潤的程度，因而HE染色未見組織形態(tài)改變。盡管炎癥會引發(fā)細胞凋亡，但與炎癥因子濃度有關，并呈濃度依賴性[37]。本研究中，模型組大鼠中腦組織無明顯細胞凋亡，推測低濃度的炎癥因子雖引發(fā)了神經細胞功能障礙，但不足以導致神經細胞凋亡。

綜上所述，壯醫(yī)藥線點灸臍環(huán)穴（3穴、6穴、9穴、12穴）、合谷、太沖可能通過調控miR-34a-5p/SIRT1信號通路，抑制miR-34a-5p表達，促進SIRT1轉錄，降低Ac-NF-κB p65水平，從而抑制NF-κB p65核轉移，減少炎癥因子分泌及舒血管神經肽CGRP釋放，發(fā)揮治療偏頭痛作用。