復(fù)方地黃顆粒對(duì)帕金森病陰虛動(dòng)風(fēng)證大鼠紋狀體GLAST、GLT-1及GAT-1表達(dá)的影響

馬利芳 ，梁建慶， ，何建成 ，董海玉 ，韓政陽 ，李斐

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 4.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一種與年齡有關(guān)的中老年疾病，隨年齡增長患病率增加。調(diào)查顯示，PD全球患病率約0.3%，65歲以上人群患病率為1%～2%，85歲以上人群患病率可達(dá)3%～5%[1-2]。PD病理改變主要是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元病理性死亡，致神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺減少及胞質(zhì)內(nèi)形成病理性路易小體。PD病因復(fù)雜，具體發(fā)病機(jī)制尚不清晰。研究顯示，谷氨酸（Glu）與γ-氨基丁酸（GABA）失衡引起的興奮性毒性是PD的主要發(fā)病機(jī)制[3-4]。復(fù)方地黃顆粒是上海中醫(yī)藥大學(xué)何建成教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)的抗PD專利方，具有滋陰熄風(fēng)、活血化痰、解毒散結(jié)功效，臨床治療PD療效較好[5]。前期研究表明，復(fù)方地黃顆粒可通過上調(diào)GABA表達(dá)，下調(diào)Glu表達(dá)，降低興奮性毒性，重建Glu和GABA之間的平衡，發(fā)揮治療PD作用[4，6]。對(duì)Glu和GABA內(nèi)部失衡因素相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLAST）、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（GLT-1）、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（GAT-1）參與調(diào)節(jié)Glu和GABA平衡，進(jìn)而參與PD發(fā)病[7-9]。本研究采用病證結(jié)合動(dòng)物模型觀察復(fù)方地黃顆粒對(duì)陰虛動(dòng)風(fēng)證紋狀體GLAST、GLT-1和GAT-1表達(dá)的影響及其調(diào)控機(jī)制，揭示復(fù)方地黃顆粒治療PD的分子機(jī)制，為PD治療提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠180只，體質(zhì)量（180±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（甘）2020-0009。飼養(yǎng)于溫度21～25 ℃、相對(duì)濕度50%～60%環(huán)境，12 h明暗交替，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)遵循甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理規(guī)定，并通過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019-176）。

1.2 藥物及制備

復(fù)方地黃顆粒（熟地黃20 g，白芍30 g，鉤藤15 g，珍珠母15 g，丹參20 g，石菖蒲12 g，全蝎2 g），由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房制備，用生理鹽水配制成濃度分別為0.175、0.35、0.7 g/mL。6-羥基多巴胺，批號(hào)MKBP1027V，美國Sigma公司。將6-羥基多巴胺溶于0.02%抗壞血酸生理鹽水溶液，制成濃度為2 μg/μL溶液，4 ℃保存。多芭絲肼片（美多芭），批號(hào)SH4189，0.25 g/片，上海羅氏制藥，用生理鹽水配制成濃度為15 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑及儀器

β-actin抗體，批號(hào)YM3028，美國Immunoway公司；GLAST抗體、GLT-1抗體、GAT-1抗體，批號(hào)分別為ab416、ab41621、ab426，英國Abcam公司。大鼠腦立體定位儀（型號(hào)BW-SAD902），上海軟隆科技發(fā)展有限公司；RT-PCR儀（型號(hào)LightCycle96），瑞士Roche公司；凝膠成像分析系統(tǒng)（型號(hào)Chemi DOC XRS+），美國Bio-Rad公司；超微量分光光度計(jì)（型號(hào)P100），美國Pultton公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（型號(hào)HT2），美國Thermo Scientific公司；病理切片機(jī)（型號(hào)RM2016），德國徠卡；包埋機(jī)（型號(hào)JB-P5），武漢俊杰電子有限公司；組織攤片機(jī)（型號(hào)KD-P），金華科迪儀器設(shè)備有限公司。

1.4 造模

大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選取22只作為正常對(duì)照組和假手術(shù)組（各11只），剩余158只進(jìn)行造模，采用Ungerstedt等[10]方法結(jié)合課題組前期改良[11]。術(shù)前大鼠禁食12 h，3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，將頭部固定于腦立體定位儀，顱頂剪毛備皮，碘伏消毒，沿正中線縱向切開，暴露顱頂，剝離骨膜，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜[12]確定右側(cè)黑質(zhì)兩坐標(biāo)（x1：前囟后5.2 mm，y1：正中線右側(cè)1.0 mm，z1：硬膜下9.0 mm；x2：前囟后5.2 mm，y2：正中線右側(cè)2.5 mm，z2：硬膜下8.5 mm），采用顱骨鉆進(jìn)行鉆孔，用微量進(jìn)針器進(jìn)針至第一坐標(biāo)，進(jìn)針?biāo)俣?.0 mm/min，注入配制好的6-羥基多巴胺溶液，每孔3 μL，注射速度1 μL/min，注射完畢留針5 min，退針?biāo)俣?.0 mm/min，顱孔填塞醫(yī)用明膠海綿，第二孔操作同上，兩孔均注射完畢后縫合切口，待大鼠清醒后放入飼養(yǎng)籠，連續(xù)7 d肌肉注射慶大霉素20萬U/只。正常對(duì)照組除固定大鼠外，不進(jìn)行任何處理。假手術(shù)組注射0.02%抗壞血酸生理鹽水溶液，其余操作相同。造模后10 d，采用阿撲嗎啡腹腔注射誘導(dǎo)大鼠，若大鼠首尾相接形成環(huán)狀向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，且開始旋轉(zhuǎn)至30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)超過7圈/min為PD陰虛動(dòng)風(fēng)證造模成功[13]。

1.5 分組及給藥

將造模成功的55只大鼠隨機(jī)分為模型組、美多芭組和復(fù)方地黃顆粒低、中、高劑量組，每組11只，另設(shè)正常對(duì)照組和假手術(shù)組各11只。造模成功后次日開始給藥，根據(jù)《定量藥理學(xué)》[14]計(jì)算大鼠用藥量，復(fù)方地黃顆粒低、中、高劑量組按1.75、3.5、7 g/kg灌胃復(fù)方地黃顆粒混懸液，美多芭組按150 mg/kg灌胃多芭絲肼溶液，1次/d，連續(xù)28 d。正常對(duì)照組、假手術(shù)組及模型組予生理鹽水灌胃。末次灌胃后禁食12 h，10%水合氯醛（30 mg/kg）麻醉并脫臼處死大鼠，分離右側(cè)紋狀體，-80 ℃冰箱保存。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)

①旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)：給藥結(jié)束后，腹腔注射阿撲嗎啡誘導(dǎo)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄大鼠開始旋轉(zhuǎn)至30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。②懸掛實(shí)驗(yàn)：將大鼠懸掛于直徑約3 mm的水平鐵絲上，當(dāng)大鼠前爪同時(shí)懸掛在鐵絲上開始計(jì)時(shí)，記錄前爪抓鐵絲的時(shí)間，每只大鼠檢測(cè)3次，每次間隔5 min，取平均值。若大鼠后爪或尾巴掛于鐵絲上則重新計(jì)時(shí)[14]。③格子實(shí)驗(yàn)：自制39 cm×27 cm×19 cm白色盒子，底部畫出3 cm×3 cm方格，安靜環(huán)境下將大鼠放入盒子內(nèi)，適應(yīng)5 min后開始觀察，記錄大鼠5 min內(nèi)移動(dòng)格數(shù)，連續(xù)檢測(cè)3次，每次間隔5 min，評(píng)估大鼠自主活動(dòng)能力。

1.6.2 RT-qPCR檢測(cè)

每組取5只大鼠，采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開顱取出整腦，冰上剝離損傷側(cè)（右側(cè)）紋狀體，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR條件：95 ℃、120 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6.3 Western blot檢測(cè)

常規(guī)法提取紋狀體蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，滴加GLAST一抗（1∶800）、GLT-1一抗（1∶1 000）、GAT-1一抗（1∶800），4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育2 h，顯影、定影、拍照，采用Image J軟件對(duì)蛋白進(jìn)行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值。

1.6.4 免疫組化檢測(cè)

取大鼠紋狀體組織制作石蠟切片，烤片脫蠟，抗原修復(fù)，去除內(nèi)源性過氧化物酶，封閉，加入GLAST一抗（1∶400）、GLT-1一抗（1∶400），GAT-1一抗（1∶500），4 ℃濕盒孵育過夜，加二抗孵育，DAB顯色，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察，陽性染色呈棕黃色或棕褐色，每組選取3張切片，每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)視野，采用Image J軟件測(cè)定陽性表達(dá)的平均光密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布用表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Tamhane” s T2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方地黃顆粒對(duì)模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響

與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯增加，懸掛時(shí)間及移動(dòng)格數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，美多芭組及復(fù)方地黃顆粒各劑量組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少，懸掛時(shí)間及移動(dòng)格數(shù)明顯增加（P＜0.01），以復(fù)方地黃顆粒高劑量組變化最明顯（P＜0.01），與美多芭組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)比較（）

表2 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)比較（）

注：與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與美多芭組比較，▲▲P＜0.01；與復(fù)方地黃顆粒低劑量組比較，□□P＜0.01；與復(fù)方地黃顆粒中劑量組比較，■■P＜0.01

移動(dòng)格數(shù)214.18±4.89 211.97±4.37 79.58±1.93**168.73±4.69##109.67±3.30##▲▲133.21±3.97##▲▲□□171.70±3.09##□□■■組別正常對(duì)照組假手術(shù)組模型組美多芭組復(fù)方地黃顆粒低劑量組復(fù)方地黃顆粒中劑量組復(fù)方地黃顆粒高劑量組只數(shù)11 11 11 11 11 11 11旋轉(zhuǎn)圈數(shù)0 0 557.73±16.35**220.18±18.50##341.82±17.76##▲▲289.91±12.66##▲▲□□231.64±12.64##□□■■懸掛時(shí)間/s 12.68±0.61 12.38±0.71 6.34±0.32**9.21±0.54##7.41±0.46##▲▲8.25±0.32##▲▲□□8.98±0.52##□□■■

2.2 復(fù)方地黃顆粒對(duì)模型大鼠損傷側(cè)紋狀體谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1 mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1 mRNA表達(dá)明顯降低，GAT-1 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，美多芭組及復(fù)方地黃顆粒各劑量組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1 mRNA表達(dá)明顯升高，GAT-1 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01），以復(fù)方地黃顆粒高劑量組效果最明顯（P＜0.01），與美多芭組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1、GAT-1 mRNA表達(dá)比較（）

表3 各組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1、GAT-1 mRNA表達(dá)比較（）

注：與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與美多芭組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與復(fù)方地黃顆粒低劑量組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與復(fù)方地黃顆粒中劑量組比較，■■P＜0.01

GAT-1 1.00±0.08 0.98±0.06 4.31±0.07**1.44±0.03##3.58±0.09##▲▲2.73±0.07##▲▲□□1.47±0.09##□□■■組別正常對(duì)照組假手術(shù)組模型組美多芭組復(fù)方地黃顆粒低劑量組復(fù)方地黃顆粒中劑量組復(fù)方地黃顆粒高劑量組只數(shù)5 5 5 5 5 5 5 GLAST 1.00±0.08 0.96±0.06 0.30±0.04**0.80±0.08##0.58±0.02##▲▲0.68±0.04##▲□0.82±0.04##□□■■GLT-1 1.00±0.01 0.96±0.03 0.13±0.00**0.78±0.03##0.33±0.03##▲▲0.49±0.04##▲▲□□0.75±0.05##□□■■

2.3 復(fù)方地黃顆粒對(duì)模型大鼠損傷側(cè)紋狀體谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1蛋白表達(dá)明顯降低，GAT-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，美多芭組及復(fù)方地黃顆粒各劑量組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1蛋白表達(dá)明顯升高，GAT-1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），以復(fù)方地黃顆粒高劑量組效果最明顯（P＜0.05，P＜0.01），與美多芭組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4、圖1。

圖1 各組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1、GAT-1蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1、GAT-1蛋白表達(dá)比較（，相對(duì)灰度值）

表4 各組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1、GAT-1蛋白表達(dá)比較（，相對(duì)灰度值）

注：與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與美多芭組比較，▲▲P＜0.01；與復(fù)方地黃顆粒低劑量組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與復(fù)方地黃顆粒中劑量組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01

GAT-1 0.54±0.03 0.58±0.03 1.20±0.06**0.75±0.02##0.97±0.01##▲▲0.89±0.02##▲▲□0.75±0.02##□□■■組別正常對(duì)照組假手術(shù)組模型組美多芭組復(fù)方地黃顆粒低劑量組復(fù)方地黃顆粒中劑量組復(fù)方地黃顆粒高劑量組只數(shù)5 5 5 5 5 5 5 GLAST 0.90±0.06 0.95±0.08 0.41±0.02**0.83±0.06##0.53±0.02#▲▲0.68±0.05##▲▲□□0.81±0.05##□□■GLT-1 0.91±0.02 0.93±0.01 0.42±0.01**0.81±0.01##0.60±0.01##▲▲0.70±0.01##▲▲□□0.82±0.01##□□■■

免疫組化結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1蛋白表達(dá)降低，GAT-1蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，美多芭組及復(fù)方地黃顆粒各劑量組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1蛋白表達(dá)升高，GAT-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），以復(fù)方地黃顆粒高劑量組效果最明顯（P＜0.05，P＜0.01），與美多芭組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表5。

圖2 各組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1、GAT-1陽性表達(dá)（免疫組化染色，標(biāo)尺=50 μm）

表5 各組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1、GAT-1蛋白表達(dá)比較（，平均光密度）

表5 各組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1、GAT-1蛋白表達(dá)比較（，平均光密度）

注：與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與美多芭組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與復(fù)方地黃顆粒低劑量組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與復(fù)方地黃顆粒中劑量組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01

GAT-1 0.050±0.003 0.049±0.002 0.093±0.001**0.061±0.004##0.083±0.004##▲▲0.072±0.003##▲▲□□0.063±0.002##□□■■組別正常對(duì)照組假手術(shù)組模型組美多芭組復(fù)方地黃顆粒低劑量組復(fù)方地黃顆粒中劑量組復(fù)方地黃顆粒高劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 3 GLAST 0.090±0.002 0.089±0.002 0.040±0.003**0.081±0.004##0.063±0.002##▲▲0.073±0.002##▲□□0.082±0.004##□□■GLT-1 0.086±0.001 0.085±0.003 0.040±0.002**0.076±0.003##0.054±0.005##▲▲0.064±0.003##▲□0.075±0.004##□□■

3 討論

PD是與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，患病率隨年齡增長而升高，是繼惡性腫瘤、心腦血管疾病外影響老年人健康的第三大殺手[2]。目前PD治療以抗膽堿能藥、多巴胺受體激動(dòng)劑、兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑等為主，但效果并不理想，且長期服藥產(chǎn)生的不良反應(yīng)會(huì)加速PD患者的運(yùn)動(dòng)行為障礙。

PD屬中醫(yī)學(xué)“顫證”范疇。何建成教授認(rèn)為，PD病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以陰虛、氣血兩虛為主，標(biāo)實(shí)以風(fēng)、火、痰、瘀、毒等為患，對(duì)此，何教授擬定具有滋養(yǎng)肝腎、平肝熄風(fēng)、活血化痰、解毒散結(jié)等功效的復(fù)方地黃顆粒[15]。方中熟地黃滋補(bǔ)腎陰，鉤藤熄風(fēng)止痙，珍珠母定驚止顫又可養(yǎng)血舒筋，白芍養(yǎng)肝血、滋肝陰，丹參活血化瘀，石菖蒲化痰開竅，全蝎解毒散結(jié)，符合PD陰虛動(dòng)風(fēng)病機(jī)，是治療PD的有效方。本研究通過旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)、懸掛實(shí)驗(yàn)及格子實(shí)驗(yàn)判斷多巴胺能神經(jīng)元損傷程度及藥物的改善作用，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加、懸掛時(shí)間縮短、移動(dòng)格數(shù)減少（P＜0.01），美多芭及復(fù)方地黃顆粒干預(yù)后，大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、懸掛時(shí)間及移動(dòng)格數(shù)均有所改善，且以復(fù)方地黃顆粒高劑量組改善最明顯（P＜0.01），與陽性藥美多芭組比較無顯著差異，說明二者療效相當(dāng)。

目前PD發(fā)病機(jī)制尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，眾多學(xué)者認(rèn)為，興奮性Glu和抑制性GABA失衡是導(dǎo)致PD發(fā)生的關(guān)鍵因素[3-4]，但具體機(jī)制尚不清楚。有研究表明，神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體是神經(jīng)信號(hào)傳遞中決定神經(jīng)效應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)鍵性分子，提示神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體可能參與調(diào)控Glu和GABA之間的平衡，進(jìn)而參與PD發(fā)病過程[16]。

神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體是位于突觸前膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其作用主要是重?cái)z取突觸間隙內(nèi)多余的神經(jīng)遞質(zhì)分子，保證突觸后膜上有足夠的分子參與神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)過程。GLAST和GLT-1承擔(dān)了90%以上突觸間隙Glu的重?cái)z取，是維持Glu神經(jīng)信號(hào)正常傳遞的關(guān)鍵分子[17]。若GLAST和GLT-1功能障礙，則突觸間隙Glu過度聚集，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，對(duì)腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元造成不可逆損傷。GLAST水平上調(diào)可降低相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)毒性，減輕多巴胺能神經(jīng)元受損程度。PD模型大鼠GLT-1含量及Glu攝取量下降，上調(diào)GLT-1能改善多巴胺能神經(jīng)元減少和行為認(rèn)知障礙，且靶向敲除黑質(zhì)GLT-1可建立新的PD病變模型[18-19]，進(jìn)一步佐證GLAST、GLT-1參與PD發(fā)病過程。GAT-1是抑制性GABA的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，承擔(dān)80%的GABA重?cái)z取，早期PD模型大鼠GAT-1下調(diào)會(huì)增強(qiáng)GABA神經(jīng)信號(hào)傳遞，進(jìn)而抑制多巴胺釋放[20]，說明多巴胺釋放受GAT-1調(diào)控。因此，調(diào)控GLAST、GLT-1、GAT-1轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)，重建興奮性Glu和抑制性GABA的平衡可能是治療PD的新靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1 mRNA及蛋白表達(dá)降低，GAT-1 mRNA及蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，美多芭組及復(fù)方地黃顆粒各劑量組大鼠損傷側(cè)紋狀體GLAST、GLT-1 mRNA及蛋白表達(dá)升高，GAT-1 mRNA及蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），且以復(fù)方地黃顆粒高劑量組最明顯。提示復(fù)方地黃顆粒可能通過上調(diào)GLAST、GLT-1表達(dá)，下調(diào)GAT-1表達(dá)發(fā)揮抗PD作用。

綜上所述，復(fù)方地黃顆粒可能通過上調(diào)GLAST、GLT-1表達(dá)，下調(diào)GAT-1表達(dá)，重建Glu與GABA之間的平衡，發(fā)揮治療PD陰虛動(dòng)風(fēng)證作用。