基于NF-κB/NLRP3通路的芍藥苷對缺氧誘導視網膜Müller細胞的影響

孔令春，鄒紅，李景景，楊宇琴，唐慧新，繆晚虹

上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203

視網膜缺氧性損傷可發生在多種視網膜血管性疾病中，如糖尿病視網膜病變、視網膜動靜脈阻塞及年齡相關性黃斑病變等。缺氧可造成視網膜結構和功能損傷，特別是視網膜神經節細胞減少或死亡，導致視力不可逆性喪失。因此，保護視網膜缺氧損傷尤為重要。目前，有關視網膜缺氧造成組織破壞的機制研究較多，包括氧化應激損傷、谷氨酸興奮毒性損傷、凋亡基因表達、神經免疫調節、炎癥損傷、病理性血管新生等[1-2]。缺氧可導致血管內皮生長因子（VEGF）表達增加，從而增加視網膜血管滲透性，引起視網膜水腫[3]。研究發現，視網膜缺氧損傷過程伴有炎癥因子釋放[4]，NLRP3炎癥小體作為固有免疫系統的重要組成部分，通過感知組織損傷、介導炎癥反應等參與多種眼部疾病的發生發展[5]。研究顯示，激活NLRP3炎癥小體既可促進VEGF生成[6]，也可促進多種炎癥因子釋放[7]。

芍藥苷是赤芍和白芍的共有成分，具有抗自由基損傷、抑制炎癥、抗纖維化、神經保護等作用[8-9]。研究發現，芍藥苷可通過抑制NLRP3炎癥小體延緩視網膜缺血性損傷大鼠視網膜神經節細胞凋亡[10]。Müller細胞作為視網膜細胞的主要大型特化的星形膠質細胞，參與血-視網膜屏障的形成，在視網膜損傷過程中起重要作用。有研究表明，芍藥苷可通過降低大鼠血糖及抑制膠質細胞活化，降低視網膜谷氨酸含量，保護視網膜Müller細胞[11]。但芍藥苷是否能通過抑制VEGF產生和炎癥發揮對視網膜Müller細胞的保護作用尚不清楚。基于此，本研究通過誘導大鼠視網膜Müller細胞rMC-1缺氧模型，觀察芍藥苷的保護作用及對NF-κB/NLRP3通路相關基因和蛋白表達的影響，為芍藥苷治療視網膜血管性疾病提供依據。

1 實驗材料

1.1 細胞及藥物

大鼠視網膜Müller細胞rMC-1，美國Kerafast公司。芍藥苷，美國Selleck公司，批號S241006。將芍藥苷粉末溶于二甲基亞砜，制成0.5 mol/L貯備液，-20 ℃避光保存，臨用前用培養基稀釋成所需濃度。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養基，美國Gibco公司，批號2366072；胎牛血清（FBS），美國Gibco公司，批號2021472；CCK8試劑盒，日本DOJINDO公司，批號CK04；白細胞介素（IL）-1β、VEGF ELISA試劑盒，上海司鼎生物科技有限公司，批號分別為SDR0004、SDR0041；Trizol RNA提取試劑，美國Invitrogen公司，批號15596018；qPCR試劑盒，日本TAKARA，批號RR420A；BCA蛋白定量試劑盒，上海司鼎生物科技有限公司，批號SD0012；兔核因子（NF）-κB p65單克隆抗體，美國CST公司，批號#8242；NLRP3抗體、半胱氨酸蛋白酶-1前體（pro-Caspase-1）+p10+p12單克隆抗體、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）抗體，英國Abcam公司，批號分別為ab263899、ab179515、ab180799；β-actin抗體，上海司鼎生物科技有限公司，批號SD0034。

CO2培養箱（日本SANYO公司，型號MCO-15AC），三氣培養箱（中國華儀寧創公司，型號Smartor 118），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號CX41），qPCR儀（瑞士Roche公司，型號LightCycler?480II），SDS-PAGE微型凝膠電泳及轉膜設備（美國Bio-Rad公司，型號1645050），低溫高速離心機（德國Eppendorf公司，型號5810R），酶標儀（美國Thermo公司，型號Multiskan FC）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

rMC-1細胞用含10% FBS、1%青鏈霉素的DMEM培養基，置37 ℃、5%CO2培養箱培養，1～2 d換液1次，細胞生長融合至85%時，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，用完全培養基終止消化后，以1∶3比例傳代，取對數生長期的3～6代細胞用于實驗。

2.2 造模及給藥條件篩選

將細胞以1×105個/孔接種至96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養箱常規培養24 h后，轉移至缺氧培養箱（1%O2）缺氧處理6、24、48 h，另設對照組正常培養相同時間，每組6個復孔，CCK8法檢測細胞活力，確定造模條件。

確定造模條件后，將細胞分為對照組、模型組和不同濃度芍藥苷組，對照組正常培養，模型組缺氧培養48 h，芍藥苷組造模同時加入終濃度分別為0、10、100、200、600、1 200 μmol/L的芍藥苷處理細胞，CCK8法檢測細胞活力，確定芍藥苷給藥濃度。

2.3 分組干預

將細胞分為對照組、模型組和芍藥苷高、低濃度組，根據確定的造模和給藥條件對照組正常培養，模型組缺氧培養48 h，芍藥苷高、低濃度組缺氧培養同時加入1 200、600 μmol/L芍藥苷處理，干預結束后收集細胞和上清液進行后續檢測。

2.4 CCK8法檢測

細胞按分組處理后，每孔加入CCK8溶液10 μL，置于培養箱孵育3 h，酶標儀波長450 nm處檢測各孔OD值，計算細胞活力（實驗組OD值÷對照組OD值×100%）。

2.5 ELISA檢測

收集細胞上清液，按試劑盒說明書操作，檢測VEGF、IL-1β含量。

2.6 Western blot檢測

收集細胞，按蛋白抽提試劑盒說明書提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，取20 μg蛋白進行凝膠電泳，轉膜后分別加入NF-κB p65一抗（1∶1 000）、NLRP3一抗（1∶1 000）、ASC一抗（1∶2 000）、pro-Caspase-1一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入HRP標記二抗（1∶20 000），37 ℃孵育1 h，顯影后用Image J 1.8.0軟件分析目的蛋白灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）灰度值比值作為蛋白相對表達量。

2.7 RT-PCR檢測

收集細胞，Trizol提取總RNA，測定RNA濃度和純度，反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，按照qPCR 試劑盒說明書進行 IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA擴增。反應體系：cDNA 1 μL，上、下游引物各 1 μL，2×Green Mix 10 μL，去離子水 7 μL；反應條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個循環。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物由上海司鼎生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統計學方法

4 結果

4.1 實驗條件建立

CCK8實驗結果顯示，與對照組比較，缺氧培養6、24 h，rMC-1細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05），缺氧培養48 h，rMC-1細胞活力顯著降低（P＜0.001），見圖1。故后續實驗選擇缺氧培養48 h為造模條件。

圖1 缺氧不同時間對rMC-1細胞活力的影響（，n=6）

不同濃度芍藥苷處理細胞后，與模型組比較，0～200 μmol/L芍藥苷對細胞活力無顯著影響（P＞0.05），600、1 200 μmol/L芍藥苷可顯著提高rMC-1細胞活力（P＜0.05，P＜0.01），見表2。故選擇芍藥苷濃度600和1 200 μmol/L用于后續實驗。

表2 不同濃度芍藥苷對rMC-1細胞活力的影響（，%）

表2 不同濃度芍藥苷對rMC-1細胞活力的影響（，%）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

濃度/（μmol/L） 細胞活力100 77.48±13.86*77.14± 9.93 81.13±10.10 84.55± 8.93 83.66±13.06 89.84±11.45#98.59±10.34##組別對照組模型組芍藥苷組0 10 100 200 600 1 200 n 6 6 6 6 6 6 6 6

4.2 芍藥苷對模型細胞上清液血管內皮生長因子和白細胞介素-1β含量的影響

與對照組比較，模型組細胞上清液VEGF、IL-1β含量顯著增加（P＜0.01，P＜0.001）；與模型組比較，芍藥苷低、高濃度組細胞上清液VEGF、IL-1β含量顯著減少（P＜0.01，P＜0.001）。見圖2。

圖2 各組rMC-1細胞VEGF、IL-1β含量比較（，n=3）

4.3 芍藥苷對模型細胞NF-κB/NLRP3通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；與模型組比較，芍藥苷高濃度組細胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.001）。見圖3、表3。

表3 各組rMC-1細胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表達比較（）

表3 各組rMC-1細胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

pro-Caspase-1 0.090±0.007 0.195±0.011***0.053±0.008###0.115±0.003###組別對照組模型組芍藥苷高濃度組芍藥苷低濃度組n 3 3 3 3 NF-κB p65 0.347±0.033 0.462±0.052*0.250±0.012###0.354±0.037#NLRP3 0.320±0.030 0.581±0.021***0.278±0.026###0.451±0.027##ASC 0.023±0.003 0.118±0.027**0.028±0.004##0.127±0.036

圖3 各組rMC-1細胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白免疫印跡

4.4 芍藥苷對模型細胞白細胞介素-1β、血管內皮生長因子和NF-κB/NLRP3通路相關基因表達的影響

與對照組比較，模型組細胞IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1基因表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.001）；與模型組比較，芍藥苷高濃度 組 細胞 IL-1β、VEGF、NF-κB、 NLRP3、 ASC、Caspase-1基因表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.001）。見表4。

表4 各組rMC-1細胞IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1 基因表達比較（）

表4 各組rMC-1細胞IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1 基因表達比較（）

注：與對照組比較，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

Caspase-1 1.013±0.202 2.752±0.250***1.454±0.125###2.096±0.188#組別對照組模型組芍藥苷高濃度組芍藥苷低濃度組n 3 3 3 3 IL-1β 1.004±0.114 9.938±2.693***1.070±0.323###2.347±0.602###VEGF 1.001±0.073 5.352±0.097***0.545±0.073###1.275±0.066###NF-κB 1.000±0.024 2.235±0.261***1.609±0.227##1.787±0.076#NLRP3 1.034±0.338 7.005±0.708***3.331±0.605###5.903±0.315 ASC 1.003±0.103 1.641±0.080***1.004±0.071###1.265±0.091##

5 討論

Müller細胞自內界膜貫穿整個視網膜到達外界膜，是視網膜內最主要的神經膠質細胞，占視網膜膠質細胞的90%。它能維持視網膜組織及結構的完整，并參與神經元營養運輸，在維持滲透壓穩定、調節突觸發育、維持電解質平衡及調節血-視網膜屏障等方面有至關重要的作用[12]。Müller細胞參與多種視網膜疾病[13]，是許多生長因子和炎癥因子產生的重要來源[14-15]。視網膜缺氧引起一系列應激反應，使Müller細胞激活，異常分泌VEGF，導致視網膜血管內皮細胞損傷，增加血管通透性，使毛細血管閉塞，進而加重視網膜缺血缺氧和促進新生血管生成[16]。此外，炎癥在缺血缺氧性視網膜疾病中的作用近年來受到廣泛關注。缺氧和視網膜炎癥密切相關[16-17]，當視網膜受到缺氧刺激時，Müller細胞活化，表現為反應性膠質激活，分泌大量炎癥細胞因子和趨化因子，如IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α等參與視網膜局部炎癥發展[18]。本研究選用Müller細胞rMC-1為研究對象，用缺氧培養方式模擬人體視網膜缺氧，發現缺氧培養48 h后，細胞活力明顯受到抑制，ELISA和PCR結果顯示，缺氧培養后，模型組rMC-1細胞分泌VEGF、IL-1β較對照組顯著增加，而芍藥苷高、低濃度組細胞IL-1β、VEGF較模型組減少，且相應基因表達顯著降低，表明芍藥苷對缺氧誘導的rMC-1細胞VEGF、IL-1β分泌有抑制作用。

NLRP3炎癥小體作為固有免疫系統的重要組成部分，是由核苷酸結合寡聚域樣受體蛋白3（NLRP3）、ASC和pro-Caspase-1組成的多蛋白復合物[19]。NLRP3炎癥小體活化包括啟動和激活2個步驟，啟動階段由Toll樣受體或細胞因子受體誘導，它們識別病原體相關分子模式（PAMPs）和損傷相關分子模式（DAMPs），使NF-κB活化，促進NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18轉錄和翻譯，PAMPs和DAMPs則促進NLRP3、ASC及pro-Caspase-1相結合，形成炎癥小體，活化Caspase-1，活化的Caspase-1將pro-IL-1β和pro-IL-18剪切為成熟形式，從而誘導下游炎癥反應，加重視網膜局部炎癥[20]。

研究發現，抑制NLRP3炎癥信號通路可改善VEGF誘導的視網膜血管新生和滲漏[21]；激活的NLRP3炎癥小體通過上調HIF-1α/VEGF軸促進人視網膜毛細血管內皮細胞VEGF分泌[6]；缺氧可誘導人視網膜色素上皮細胞NLRP3炎癥小體啟動和激活，促進VEGF基因表達和分泌[22]。也有研究指出，高糖誘導能顯著提高人視網膜色素上皮細胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平，且與高糖活化NF-κB和激活NLRP3炎癥小體有關[23]。Zhang等[7]發現，慢性高眼壓大鼠NLRP3炎癥小體激活同時，TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-18等促炎因子含量增加。可見，在視網膜病變中，NLRP3炎癥小體與VEGF表達關系密切。

芍藥苷為水溶性單萜糖苷，具有鎮靜、護肝、抗炎和調節免疫等多種作用[24]。芍藥苷的抗炎作用研究尤為廣泛，包括類風濕關節炎[25]、神經炎癥[26]、糖尿病足潰瘍[27]等。本研究結果顯示，芍藥苷能降低缺氧rMC-1細胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1基因及蛋白表達，提示其可能通過抑制NF-κB/NLRP3通路，抑制NLRP3炎癥小體激活，進而抑制視網膜炎癥反應。

綜上所述，芍藥苷可能通過抑制NF-κB/NLRP3通路下調細胞因子VEGF、IL-1β表達，減輕缺氧誘導的視網膜Müller細胞損傷。但其與該通路的具體結合方式及其他作用途徑尚不清楚，有待后期進一步深入探究。本研究結果可為缺氧性視網膜血管疾病的防治提供一定參考。