不同批次還少膠囊重金屬元素含量測(cè)定及其健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

王丹 ，楊青山 ，江春陽(yáng) ，鄒隆瓊 ，唐建 ，周全 ，周游 ，周濃

1.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫(kù)區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 404120；2.重慶三峽云海藥業(yè)股份有限公司，重慶 404500

還少膠囊由《洪氏集驗(yàn)方》還少丹改進(jìn)而成，用于治療男科、婦科等疾病[1]。該方由熟地黃、山茱萸、肉蓯蓉、牛膝、茯苓等15種中藥組成，具有溫腎補(bǔ)脾、養(yǎng)血益精功效，常用于脾腎虛損、陽(yáng)痿遺精、耳鳴目眩、精血虧耗等[2]。大量研究表明，還少膠囊對(duì)弱精子癥[3-4]、月經(jīng)不調(diào)[5]、多囊卵巢綜合征[6]等具有良好療效。中成藥以其藥效溫和、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)[7]而占有較高的市場(chǎng)份額，但其原料藥材在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)因富集作用和主動(dòng)吸收而存在重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)[8]。近年來(lái)，中藥材重金屬污染問(wèn)題越來(lái)越受關(guān)注，很多科研人員對(duì)中藥材重金屬元素含量進(jìn)行測(cè)定[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，藥材中重金屬及有害金屬元素含量超標(biāo)現(xiàn)象普遍存在，重金屬有害元素會(huì)通過(guò)消化吸收進(jìn)入到人體，在體內(nèi)重金屬元素含量積累過(guò)多，會(huì)對(duì)人體多器官造成嚴(yán)重危害[11-12]。

電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）為重金屬元素常用的檢測(cè)方法[13]，作為目前痕量元素分析領(lǐng)域先進(jìn)的檢測(cè)方法，具備分析快、精密度高的優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)檢測(cè)多種元素[14]。本研究采用ICP-MS對(duì)11批還少膠囊中的銅（Cu）、砷（As）、鎘（Cd）、汞（Hg）和鉛（Pb）元素含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)比較每日暫定最大攝入量（estimated daily intake，EDI）和每日暫定可耐受攝入量（provisional tolerable daily intake，PTDI）評(píng)估還少膠囊健康風(fēng)險(xiǎn)，并結(jié)合靶向危害系數(shù)（target hazard quotients，THQ）評(píng)估推薦攝入量下還少膠囊中5種重金屬元素含量對(duì)成年人的非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)，以期為還少膠囊的質(zhì)量安全性評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

ICP-MS儀（杭州聚光科技股份有限公司，型號(hào)EXPEC 7000）；微波消解儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司，型號(hào)金牛4010）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)SB-5200 DTN）；電子分析天平（上海津平科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)FA 2004）。

Cu（批號(hào)GSB04-1725-2004）、As（批號(hào)GSB04-1714-2004）、Cd（批號(hào)GSB04-1721-2004）、Hg（批號(hào)GSB04-1729-2004）、Pb（批號(hào)GSB04-1742-2004）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL），鍺（Ge，批號(hào)GSB04-1728-2004）、鉍（Bi，批號(hào) GSB04-1719-2004）、銦（In，批號(hào)GSB04-1731-2004）內(nèi)標(biāo)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/mL），國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。硝酸（優(yōu)級(jí)純，四川西隴科學(xué)有限公司）；水為怡寶牌純凈水。實(shí)驗(yàn)用容量瓶、燒杯、移液管等玻璃儀器均用10%HNO3溶液浸泡24 h，去離子水洗凈，烘干，備用。

11批還少膠囊樣品為市售，重慶三峽云海藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。S1～S5（批號(hào)分別為170602NO·058、190602NO·035、190903NO·101、191006、191007），規(guī)格0.42 g/粒，15種中藥原料1 000粒處方量為640 g[熟地黃60 g，山藥（炒）60 g，牛膝40 g，枸杞子40 g，山茱萸40 g，茯苓60 g，杜仲（鹽制）40 g，遠(yuǎn)志（甘草炙）40 g，巴戟天（炒）40 g，小茴香（鹽制）40 g，楮實(shí)子40 g，肉蓯蓉40 g，石菖蒲20 g，大棗（去核）60 g]； S6～S11 （ 批 號(hào) 分 別 為 190802NO·003、180601NO·132、 181205NO·081、 190101NO·081、181101NO·003、181101NO·004），規(guī)格0.38 g/粒，15種中藥原料1 000粒處方量為1 100.3 g[熟地黃100 g，山藥（炒）100 g，牛膝66.7 g，枸杞子66.7 g，山茱萸66.7 g，茯苓100 g，杜仲（鹽制）66.7 g，遠(yuǎn)志（甘草灸）66.7 g，巴戟天（炒）66.7 g，小茴香（鹽制）66.7 g，楮實(shí)子66.7 g，肉蓯蓉66.7 g，石菖蒲33.3 g，大棗（去核）100 g]。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件

射頻功率1 550 W，冷卻氣流速14.000 L/min，輔助氣流速1.00 L/min，霧化氣流速1.122 L/min，碰撞氣體流速4.218 mL/min，霧化室溫度2.70 ℃，采樣次數(shù)為3次，采樣深度5.00 mm，進(jìn)樣泵轉(zhuǎn)速40 r/min，數(shù)據(jù)采集方式為跳峰。As、Cu以Ge為內(nèi)標(biāo)，Cd以In為內(nèi)標(biāo)，Pb、Hg以Bi為內(nèi)標(biāo)，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度由低向高進(jìn)行測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)、響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定樣品溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)樣品濃度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別精密量取Cu、As、Cd、Hg、Pb各單元素標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，用2%硝酸溶液逐級(jí)稀釋制成各元素的系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，Pb、Cd、As濃度為0、1、5、10、30、50、100 ng/mL，Cu濃度為0、10、50、100、300、500、1 000 ng/mL，Hg 濃度為 0、0.02、0.1、0.2、0.6、1、2 ng/mL。分別精密量取Bi、Ge、In各單元素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用水稀釋為1 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 供試品溶液制備

取出還少膠囊內(nèi)容物，精密稱取0.50 g，置于四氟乙烯消解罐中，加7.0 mL硝酸，放入微波消解儀中進(jìn)行消解，程序如下：0～12 min，室溫→120 ℃；12～14 min，120 ℃；14～16 min，120 ℃→150 ℃；16～18 min，150 ℃；18～20 min，150 ℃→180 ℃；20～50 min，180 ℃。消解結(jié)束后，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶，用少量水潤(rùn)洗消解罐3次，洗液倒入容量瓶，加水定容至刻度，搖勻，備用。另取7 mL硝酸同法制備空白溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察與檢測(cè)限

取“2.2”項(xiàng)下系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，以測(cè)定的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到Cu、As、Cd、Hg、Pb元素回歸方程，分別計(jì)算5種元素的檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5種元素線性關(guān)系考察結(jié)果及檢測(cè)限

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取Cd、As、Pb、Cu、Hg濃度分別為10、10、10、100、1.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)測(cè)定6次，記錄測(cè)定值，計(jì)算RSD。結(jié)果Cu、As、Cd、Hg、Pb測(cè)定值的RSD分別為2.05%、2.41%、2.43%、2.75%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批還少膠囊（S1）樣品6份，每份約0.50 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄測(cè)定值，并計(jì)算RSD。結(jié)果Cu、As、Cd、Hg、Pb測(cè)定值的RSD分別為2.64%、2.03%、2.73%、2.24%、1.10%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的還少膠囊樣品（S1）6份，每份約0.25 g，分別加入Cu、As、Cd、Hg、Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄測(cè)定值，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。5種元素的平均回收率為98.33%～101.66%，RSD為1.82%～4.59%，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表2 5種元素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定

稱取11批還少膠囊樣品，每批平行3份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，11批還少膠囊樣品中5種重金屬元素含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。還少膠囊樣品Cu含量為2.575～5.737 mg/kg、As含量為 0.339～1.299 mg/kg、Hg含量為 0.007～0.133 mg/kg、Pb含量為0.521～1.688 mg/kg、Cd含量為0.007～0.031 mg/kg，樣品S4、S5和S9中Cd元素未檢出。其中樣品S7中5種重金屬元素含量最高，樣品S4中5種重金屬元素含量最低。

表3 5種元素含量測(cè)定結(jié)果（mg/kg，n=3）

2.6 重金屬元素健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

參照文獻(xiàn)[15-17]方法，對(duì)還少膠囊中5種重金屬元素進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

2.6.1 每日暫定最大攝入量計(jì)算

2.6.2 靶向危害系數(shù)計(jì)算

采用美國(guó)環(huán)保局（U.S. Environmental Protection Agency，USEPA，https://www.epa.gov/）提出的THQ對(duì)不同批次還少膠囊中重金屬元素在人體食用攝入中的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。式中，C為藥材中重金屬質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/kg），EF為每年暴露于毒物天數(shù)（d），ED為暴露于毒物的年數(shù)（y），IRD為每日攝入量（g），BW為成年人平均體質(zhì)量（kg），AT為平均接觸非致癌毒物時(shí)間（d），RFD為參考劑量（μg/g）。EF取值30 d，ED取值30 y，AT按人類平均壽命（70歲）計(jì)算為70×365 d，RFD采用USEPA提供數(shù)值：RFDCu=0.04 mg/（kg?d）、RFDAs=0.000 3 mg/（kg?d）、RFDCd=0.001 mg/（kg?d）、RFDHg=0.000 3 mg/（kg?d）、RFDPb=0.001 5 mg/（kg?d）。若THQ＜1，則代表人體攝入的重金屬元素量不會(huì)對(duì)其健康產(chǎn)生明顯影響[18]。

2.6.3 樣品重金屬元素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

成年人服用還少膠囊后5種重金屬元素的EDI和THQ計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。11批還少膠囊樣品中5種重金屬元素的EDI均低于PTDI，且Cu＞Pb＞As＞Hg＞Cd，以此為評(píng)估指標(biāo)，可以認(rèn)為成年人在服用還少膠囊后重金屬元素負(fù)荷量對(duì)其健康無(wú)明顯影響；若以THQ為評(píng)估指標(biāo)，11批還少膠囊樣品中5種重金屬元素的THQ和總THQ均小于1，且As＞Pb＞Cu＞Hg＞Cd，表明利用該健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型進(jìn)行評(píng)估，本試驗(yàn)所有采樣批次還少膠囊中重金屬元素對(duì)暴露人群的健康均不會(huì)產(chǎn)生明顯影響。

表4 還少膠囊樣品重金屬EDI和THQ

2.7 相關(guān)性分析

采用SPSS22.0軟件對(duì)11批還少膠囊樣品Cu、As、Cd、Hg、Pb含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表5。可以看出，Cu和Pb元素含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.403，P＜0.05），其余元素之間不存在顯著相關(guān)性。

表5 還少膠囊中5種元素含量相關(guān)性分析

2.8 主成分分析

采用SPSS22.0軟件對(duì)11批還少膠囊5種元素含量進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)表6、表7。5種元素中提取出3個(gè)主成分（特征值＞1），累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)83.13%。第1主成分主要表示Cd、Pb的含量信息，方差貢獻(xiàn)率為36.05%；第2主成分主要表示Hg、Pb的含量信息，方差貢獻(xiàn)率為26.75%；第3主成分主要表示As的含量信息，方差貢獻(xiàn)率為20.33%。

表6 還少膠囊5種元素含量主成分特征值及貢獻(xiàn)率

表7 還少膠囊5種元素含量主成分載荷

3 討論

中藥材重金屬元素含量超標(biāo)現(xiàn)象普遍存在，影響了中藥材市場(chǎng)的發(fā)展，同時(shí)也限制了中藥的國(guó)際應(yīng)用[19-20]。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》僅對(duì)山茱萸的重金屬及有害元素做出規(guī)定（通則2321原子吸收分光光度法或電感耦合等離子體質(zhì)譜法）[21]：Pb不得過(guò)5 mg/kg，Cd不得過(guò)l mg/kg，As不得過(guò)2 mg/kg，Hg不得過(guò)0.2 mg/kg，Cu不得過(guò)20 mg/kg。本研究測(cè)定11批還少膠囊樣品發(fā)現(xiàn)，5種重金屬元素含量有明顯差異，其中Cu和Pb含量相對(duì)較高，As、Cd和Hg含量較低。結(jié)合還少膠囊生產(chǎn)處方1 000 g制劑的原料量（0.42 g/粒，原料0.64 g；0.38 g/粒，原料1.100 3 g），參考《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》（WM/T2-2004）和2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》限量規(guī)定，11批還少膠囊樣品5種元素含量均未超標(biāo)。本研究通過(guò)比較EDI和PTDI，建立THQ健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型對(duì)不同批次還少膠囊中5種重金屬進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果顯示，按照建議攝入量，所有采樣批次還少膠囊中5種重金屬均不會(huì)對(duì)成年人身體健康造成明顯不良影響。

綜上，本研究為還少膠囊的安全性評(píng)價(jià)提供了研究思路，可為還少膠囊特定受用人群的安全用藥提供數(shù)據(jù)支撐，并為進(jìn)一步完善不同類型中成藥的安全質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、提高中成藥使用安全性提供一定基礎(chǔ)。