腦脊液miR-139、miR-22水平對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤的診斷價(jià)值研究*

代洛陽(yáng)，劉玉潔，許 可，李 濤△，龔虹云

武漢大學(xué)人民醫(yī)院：1.神經(jīng)內(nèi)科;2.腫瘤中心，湖北武漢 430060

腦轉(zhuǎn)移瘤是惡性腫瘤的一種并發(fā)癥，是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要原因。有研究顯示，非小細(xì)胞肺癌是腦轉(zhuǎn)移瘤的原發(fā)腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌患者腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率超過(guò)20%[1]。肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的亞型，約占肺癌患者的40%，與其他亞型的非小細(xì)胞肺癌相比，其發(fā)生早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移的概率較高[2]。腦轉(zhuǎn)移瘤是肺腺癌預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，會(huì)使患者中位生存時(shí)間顯著減少[3]，因此找尋新的特異性診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)早期診斷和治療肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤具有重要的價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNA)的異常表達(dá)與多種疾病發(fā)生密切相關(guān)，miRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，是疾病早期診斷的潛在生物標(biāo)志物[4]。miR-139在乳腺癌組織及癌細(xì)胞中低表達(dá)，是浸潤(rùn)性乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)[5]。miR-139-5p有抑癌作用，與非小細(xì)胞肺癌臨床病理參數(shù)相關(guān)[6]。miR-22同有抑癌作用，在上皮性卵巢癌患者血清中低表達(dá)，可作為卵巢癌早期診斷的生物標(biāo)志物[7]。YANG等[8]研究顯示，miR-22-3p模擬物可抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。miR-139、miR-22均參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，與癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)，但它們是否與肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生有關(guān)目前報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者腦脊液miR-139、miR-22水平，探討其對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤的診斷價(jià)值，以期為臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2021年12月本院收治并確診為肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者80例作為肺腺癌腦轉(zhuǎn)移組，男43例、女37例，年齡47～78歲，平均(60.26±7.13)歲，其中吸煙者30例。另外，選取同期單純肺腺癌無(wú)轉(zhuǎn)移患者60例作為肺腺癌無(wú)轉(zhuǎn)移組，男35例、女25例，年齡46～80歲，平均(60.37±6.94)歲，其中吸煙者25例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合肺腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，且經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)；(2)經(jīng)顱腦磁共振檢查診斷為腦轉(zhuǎn)移；(3)為初治患者，進(jìn)行本研究前未行放、化療等相關(guān)治療；(4)有完整臨床資料的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有代謝性或傳染性疾病；(2)肝、腎等重要臟器功能不全；(3)有其他惡性腫瘤病史。肺腺癌腦轉(zhuǎn)移組和肺腺癌無(wú)轉(zhuǎn)移組比較，年齡、性別、吸煙史差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，原發(fā)腫瘤數(shù)目、原發(fā)腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

表1 肺腺癌無(wú)轉(zhuǎn)移組和肺腺癌腦轉(zhuǎn)移組一般資料比較

1.2方法

1.2.1腦脊液標(biāo)本收集 患者在進(jìn)行腰椎穿刺或鞘注化療時(shí)，抽取腦脊液10 mL置于無(wú)菌離心管中，于-20 ℃保存，待測(cè)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定腦脊液中miR-139、miR-22水平 采用Trizol試劑[購(gòu)自上海通蔚生物有限公司，批號(hào)：KM10574]提取腦脊液總RNA。然后，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)J-6041L)和PCR試劑盒(批號(hào)M-3017L)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行，以U6為內(nèi)參，反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 5 s，70 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。引物由上海通蔚生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-139、miR-22相對(duì)表達(dá)水平。

表2 引物序列

1.2.3肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 人肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：CSA-30172)。A549細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，在含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。A549細(xì)胞在不含抗菌藥物的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，根據(jù)Lipofectamine 3000試劑盒(武漢尚恩生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：CSA-60157)說(shuō)明書(shū)，將購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物公司的miR-139模擬物(mimic)、miR-22 mimic、miR-139抑制物(inhibitor)、miR-22 inhibitor分別以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，依次記為miR-139 mimic組、miR-22 mimic組、miR-139 inhibitor組、miR-22 inhibitor組，另以未轉(zhuǎn)染的正常A549細(xì)胞作為對(duì)照(Control)組。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組A549細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，然后按照1.2.2中的方法檢測(cè)miR-139、miR-22的水平，以此判斷轉(zhuǎn)染是否成功。各組均設(shè)6個(gè)平行檢測(cè)樣本。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)肺腺癌細(xì)胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，88 μm孔徑的插入物被放置在24孔板中，以分離上腔與下腔。上腔預(yù)涂基質(zhì)膠后，加入含(3～5)×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液200 μL，下腔加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基500 μL，侵襲下腔的細(xì)胞用70%甲醇固定，24 h后用0.5%結(jié)晶紫處理，于倒置顯微鏡(北京誠(chéng)聚德生物技術(shù)有限公司，型號(hào)IX83)下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，均勻鋪種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，用200 μL無(wú)菌槍頭垂直劃過(guò)板底的細(xì)胞層，形成劃痕，滴加無(wú)菌PBS洗滌去除漂浮細(xì)胞，即刻在光鏡下拍照，標(biāo)記為0 h，加入2 mL含1% FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，光鏡下拍照觀察劃痕愈合情況，標(biāo)記為24 h。采用ImageJ軟件測(cè)量劃痕距離，劃痕愈合率可表示細(xì)胞遷移能力(劃痕愈合率越高代表細(xì)胞遷移能力越強(qiáng))，劃痕愈合率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

2 結(jié) 果

2.1肺腺癌無(wú)轉(zhuǎn)移組和肺腺癌腦轉(zhuǎn)移組患者腦脊液中miR-139、miR-22水平比較 與肺腺癌無(wú)轉(zhuǎn)移組相比，肺腺癌腦轉(zhuǎn)移組患者腦脊液中miR-139、miR-22水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 肺腺癌無(wú)轉(zhuǎn)移組和肺腺癌腦轉(zhuǎn)移組患者腦脊液中miR-139、miR-22水平比較

2.2肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平的平均值(分別為0.76、0.77)將其進(jìn)行分組：miR-139高表達(dá)組35例(miR-139≥0.76)，miR-139低表達(dá)組45例(miR-139<0.76)；miR-22高表達(dá)組32例(miR-22≥0.77)，miR-22低表達(dá)組48例(miR-22<0.77)。肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平與年齡、性別、是否吸煙無(wú)關(guān)(P>0.05)，與原發(fā)腫瘤數(shù)目、原發(fā)腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.3肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者腦脊液中miR-139與miR-22水平呈正相關(guān)(r=0.432，P=<0.001)，見(jiàn)圖1。

圖1 肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平的相關(guān)性分析

2.4影響肺腺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移瘤的危險(xiǎn)因素分析 將2.2中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量(原發(fā)腫瘤數(shù)目、原發(fā)腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-139、miR-22)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：多個(gè)原發(fā)腫瘤、原發(fā)腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-139低表達(dá)、miR-22低表達(dá)是肺腺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移瘤的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 Logistic回歸分析影響肺腺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移瘤的危險(xiǎn)因素

2.5腦脊液中miR-139、miR-22水平對(duì)肺腺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移瘤的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，腦脊液中miR-139、miR-22單獨(dú)及二者聯(lián)合診斷肺腺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移瘤的曲線下面積(AUC)分別為0.827、0.795、0.953，二者聯(lián)合優(yōu)于miR-139、miR-22各自單獨(dú)診斷(Z=1.766、2.178，P=0.038、0.029)。見(jiàn)圖2、表6。

表6 腦脊液中miR-139、miR-22水平對(duì)肺腺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移瘤的診斷價(jià)值

圖2 腦脊液中miR-139、miR-22水平診斷肺腺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移瘤的ROC曲線

2.6miR-139、miR-22高低表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響 與Control組相比，miR-139 mimic組miR-139、miR-22 mimic組miR-22水平均顯著升高(P<0.05)，miR-139 mimic組和miR-22 mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率顯著降低(P<0.05)；與Control組相比，miR-139 inhibitor組miR-139、miR-22 inhibitor組miR-22水平顯著降低，miR-139 inhibitor組和miR-22 inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表7。

圖3 各組肺腺癌細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)和遷移(×100)圖

表7 miR-139、miR-22高低表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響

3 討 論

腦轉(zhuǎn)移瘤是惡性腫瘤致死性并發(fā)癥，常發(fā)生在肺腺癌晚期，會(huì)引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累，造成機(jī)體神經(jīng)功能異常。目前，臨床對(duì)于肺腺癌患者治療多采用放療和化療，以提高腫瘤局部控制率和延長(zhǎng)患者生存期，但發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的概率增加[10]。腦轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后較差，若不予治療，多數(shù)患者死于神經(jīng)功能系統(tǒng)衰退。miRNA是一種短鏈非編碼RNA，與腫瘤的發(fā)生緊密相關(guān)，miRNA可以通過(guò)與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)其降解蛋白或抑制蛋白翻譯，參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲等各個(gè)階段，可作為潛在的腫瘤診斷生物學(xué)標(biāo)志物。

miR-139是一種腫瘤抑制因子，在肺鱗癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。ZHANG等[11]研究顯示，miR-139-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)顯著下調(diào)，在體外miR-139-5p過(guò)表達(dá)可顯著抑制癌細(xì)胞的活力和增殖并誘導(dǎo)其凋亡，抑制miR-139-5p表達(dá)可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和化療耐藥性的產(chǎn)生。提示，miR-139與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。miR-22位于第17號(hào)染色體上，由22個(gè)核苷酸組成。miR-22的表達(dá)失調(diào)與多種癌癥疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。WONGJAMPA等[12]研究顯示，miR-22在宮頸癌中是一個(gè)抑癌因子，可以抑制癌細(xì)胞增殖和遷移并誘導(dǎo)其凋亡，是宮頸癌的候選治療靶標(biāo)。HE等[13]研究顯示，miR-22-3p在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，可能為非小細(xì)胞肺癌提供潛在的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌腦轉(zhuǎn)移組患者腦脊液中miR-139、miR-22水平顯著低于肺腺癌無(wú)轉(zhuǎn)移組，提示miR-139、miR-22的異常表達(dá)參與肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生。

肺腺癌發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的機(jī)制較為復(fù)雜，肺腺癌的N分期、M分期、TNM分期、近期療效可能是影響肺腺癌腦轉(zhuǎn)移的重要因素[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平與原發(fā)腫瘤數(shù)目、原發(fā)腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-139、miR-22水平可能成為肺腺癌腦轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物。miR-139、miR-22水平呈正相關(guān)，表明二者可能存在相互作用關(guān)系。SHAO等[15]研究報(bào)道，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析非小細(xì)胞肺癌中miRNA與mRNA相互作用失調(diào)的網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)miR-139-5p為診斷非小細(xì)胞肺腺癌的新型生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-139低表達(dá)、miR-22低表達(dá)是肺腺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移瘤的危險(xiǎn)因素，腦脊液中miR-139、miR-22對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤具有一定的診斷價(jià)值，二者聯(lián)合用于診斷的效果更好。此外，本研究中的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明miR-139、miR-22可通過(guò)調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移影響腦轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生，進(jìn)一步證實(shí)miR-139、miR-22對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤具有一定的診斷價(jià)值。

綜上所述，肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22均呈低表達(dá)，二者對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤均有一定的診斷價(jià)值。但本研究還有一些不足，如未對(duì)患者進(jìn)行隨訪，還需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步實(shí)施多中心的前瞻性試驗(yàn)研究。