1例疑難血型的血清學和基因定型處理體會

李雪晨,王加勇,陸紫敏,方 琦,鄭 浩,周 濤,丁 懿

同濟大學附屬同濟醫院輸血科，上海 20065

輸血在臨床救治患者中起著關鍵作用，血型鑒定正確是保證臨床輸血安全的重要前提。患者在輸血前進行血型鑒定，通過正反定型一致確保ABO血型準確，但病理條件下，尤其是惡性血液病患者，血型抗原缺失或表達減弱，會發生血型鑒定困難[1]。抗-M是MSN血型系統常見抗體，抗-M會引起ABO血型鑒定困難與交叉配血不合，影響輸血[2]。本實驗室使用血型血清學和聚合酶鏈反應-序列特異性引物(PCR-SSP)方法處理了1例同時存在上述2 種情況的患者，報道如下。

1 資料與方法

1.1病歷資料 患者，女，65歲，漢族，因頭暈乏力，胸悶氣促，于2021年11月8日夜間到本院急診內科就診。患者在外院確診為多發性骨髓瘤1年半，重度貧血貌，胸悶，明顯氣促，心率114次/min，顯著增快，雙肺呼吸音粗，左側呼吸音減弱，行胸部CT檢查提示雙肺感染。急診查血常規，白細胞計數(WBC)為3.05×109/L，血紅蛋白濃度(Hb)為31 g/L，紅細胞計數(RBC)為1.02×1012/L，血小板計數(PLT)為52×109/L，患者嚴重貧血，急診申請輸注紅細胞懸液4個單位。因患者ABO血型鑒定正反定型不一致，患者急需輸血，輸血科啟動緊急用血應急預案進一步處理。

1.2儀器與試劑 ABO/Rh(D)血型定型檢測卡(西班牙GRIFOLS，批號21007.01)，不規則抗體篩檢卡(西班牙GROFOLS，批號21094.01)，凝聚胺試劑(珠海貝索，批號A201205)，抗A/抗B血型定型試劑(長春博得，批號20210605)，RhD(IgM)血型定型試劑(長春博得，批號SY20210201)，抗人球蛋白(抗IgG，C3d)檢測試劑(上海血液生物，批號20205001)，ABO血型反定型試劑(紅細胞，長春博得，批號20210920)，不規則抗體檢測試劑(紅細胞，長春博得，批號是20210918)，抗體鑒定譜細胞(上海血液生物，批號20210924)，抗-M、抗-N血型定型試劑(上海血液生物，批號20210608)，紅細胞ABO血型基因分型試劑盒(天津秀鵬生物，202004001)，核酸提取或純化試劑(天津秀鵬生物，202108003)，PCR儀(杭州博日，Life ECO)，核酸電泳儀(北京君意，JY300C)，核酸成像分析儀(北京君意，JYO2S)，全自動配血及血型分析儀(西班牙GRIFOLS，WADiana)，細胞洗滌離心機(日本久保田，KA-2200)，離心機(日本久保田，2420型)，三用電熱恒溫水箱(常州翔天，XMTD-204)，冰箱(青島Haier，HYCD-205)。

1.3方法

1.3.1PCR-SSP法檢測 患者簽署同意書后，取新鮮EDTA抗凝全血2 mL，用核酸提取或純化試劑從全血中提取DNA，采用紫外分光光度計檢測DNA含量為20.39 ng/μL，A260/A280比值為1.76。采用PCR-SSP法檢測ABO血型基因，PCR反應體系總體積120.9 μL，其中0.9 μL Taq酶(5 units/μL)，10 μL DNA(22 ng/μL)，110 μL dNTP-Buffer工作液，分別向紅細胞ABO血型基因分型試劑盒的引物孔(1～11孔)中各加入10 μL上述混合液。調整好反應程序，置Life ECO型PCR儀上進行擴增。PCR反應條件為：在96 ℃預變性2 min，進入循環擴增階段，96 ℃ 20 s，68 ℃ 60 s，循環5次；96 ℃ 20 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循環10次；96 ℃ 20 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，循環15次；72 ℃ 3 min；最后在4 ℃條件下保存。將PCR產物轉移至2.5%瓊脂糖凝膠孔中，JY300C核酸電泳儀電泳15 min，在JYO2S核酸成像分析儀下觀察條帶結構，依據結果分型表判斷血型檢測結果。

1.3.2血清學試驗 ABO/Rh血型鑒定、不規則抗體篩查采用微柱凝膠卡法和試管法，抗體鑒定譜細胞檢測采用試管法，交叉配血聯合采用鹽水試管法、聚凝胺法和抗球蛋白柱凝集法，Rh分型、直接抗人球蛋白試驗(DAT)采用試管法。實驗操作均按照標準操作規程執行[3]。

1.3.3吸收試驗 將3人份O型Rh陽性MN表型為MM的獻血員紅細胞混合，用生理鹽水將上述紅細胞洗滌3次，取1 mL壓積紅細胞，加入等量患者血清，4 ℃吸收2 h，每30 min搖動1次，用離心獲得的患者血清吸收液進行ABO血型鑒定。

2 結 果

2.1血型鑒定與抗體篩查 患者ABO血型鑒定結果見表1，正定型結果為Aweak，反定型結果為O型，試管法反定型在顯微鏡鏡下可見A1紅細胞凝集，加生理鹽水后凝集未散開，正反定型結果不一致；患者Rh血型是DCCee。患者血漿與抗體篩查細胞Ⅰ和篩查細胞Ⅱ凝集，結果見表2。患者紅細胞做直接抗球蛋白試驗(DAT)結果為陰性。

表1 患者ABO血型鑒定正反定型結果

表2 患者不規則抗體篩查結果

2.2PCR-SSP法檢測 ABO基因分型結果見圖1，患者基因型為AO1，表型為A型。

圖1 PCR-SSP法檢測ABO基因分型結果

2.3抗體鑒定 患者血清與抗體鑒定譜細胞反應，格局為1、2、5、6、8和10號細胞均1+，3、4、7和9號細胞均陰性，自身紅細胞對照陰性。對照譜細胞試劑盒(上海血液生物，批號20210924)抗原格局表，判定患者體內存在抗-M抗體。紅細胞血型抗體鑒定細胞反應格局表見表3。

表3 紅細胞血型抗體鑒定細胞反應格局表

2.4吸收試驗 冷吸收后患者ABO血型鑒定試管法結果見表4，ABO血型為A型，正反定型一致，證實抗-M抗體存在。

續表3 紅細胞血型抗體鑒定細胞反應格局表

表4 冷吸收后患者ABO血型鑒定結果

2.5交叉配血 與4個單位M抗原陰性的A型Rh分型為DCCee的紅細胞做交叉配血試驗，主側和次側在鹽水、凝聚胺及抗球蛋白介質中均無聚集，無溶血。患者當天夜間輸注上述4 U去白細胞懸浮紅細胞后，血紅蛋白由輸血前31 g/L上升到60 g/L，紅細胞計數由輸血前1.12×1012/L上升到2.17×1012/L，證明輸血有效。

3 討 論

在臨床輸血治療過程中，正確的血型鑒定是確保輸血安全的首要條件。近年來，分子生物學法在ABO疑難血型鑒定中被廣泛應用[4]。開展疑難ABO血型基因分型檢測，與血清學鑒定技術相結合，可以快速、準確地鑒定出疑難ABO血型，順利解決疑難血型鑒定的問題。

該患者的血型鑒定試驗中，反定型試管法A1c、Oc在不同溫度條件下凝集強度一致，排除是由于冷凝集素干擾引起的正反定型結果不一致[5]。該病例為多發性骨髓瘤患者，考慮可能存在大量異常血漿蛋白干擾，反定型A1c加1滴0.9%生理鹽水混勻，在顯微鏡鏡下觀察凝集未消失，排除是由于血漿蛋白異常引起的假凝集[6]。該病例與A亞型的血清學典型特征類似，正定型中紅細胞與抗-A發生弱凝集(+1)，在反定型中與健康者的A1紅細胞發生弱凝集(+1)，疑似為A亞型[7]，本實驗室選擇PCR-SSP法檢測ABO血型基因。

該患者ABO基因分型為AO1，表型為A型，可排除ABO亞型，患者正定型結果為Aweak，有文獻報道，ABO抗原減弱常見于惡性白血病，尤其在急性髓細胞白血病多見，其次是骨髓增生異常綜合征，與本病例相符[8]。該患者血清只與抗體篩查細胞Ⅰ、Ⅱ反應凝集，不是與3個抗體篩查細胞均反應凝集，且患者直接抗球蛋白試驗結果為陰性，可排除是由于自身抗體存在造成的血型定型困難[9]。本實驗室選擇對患者進行抗體鑒定，依據譜細胞篩查結果，判定患者體內存在抗-M抗體。雖然患者反定型中未出現O細胞凝集現象，但吸收試驗結果證實了抗-M抗體的存在，也有效消除抗-M抗體對血型鑒定的干擾，確認患者ABO血型為A型，給患者輸注4單位M抗原陰性的A型懸浮紅懸液后，患者紅細胞總數和血紅蛋白均上升，輸血有效。

本實驗室認為輸血科在臨床輸血實踐中，開展血型基因分型檢測，可以作為血清學方法的有效補充，能在疑難血型的診斷中發揮重要作用，也能大大減少急診患者用血等待時間，為臨床輸血二級學科發展注入動力，保障臨床用血安全、合理、有效。