SLAMF6、BCL-2/Bax對重型再生障礙性貧血患者HSCT療效的預測價值分析*

劉曉燕，劉文超，尹婷婷

邯鄲市第一醫院：1.血液內科；2.老年病一科，河北邯鄲 056000

重型再生障礙性貧血(SAA)是骨髓造血功能衰竭引起的一種血液系統重癥，具有發病急、進展快及病死率高等特征[1]。目前,強化免疫抑制治療及造血干細胞移植(HSCT)是臨床治療SAA的重要手段，但前者初次治療失敗率可達30%以上，且治療有效的患者亦存在10%～20%的復發風險，而HSCT優勢在于造血重建快，長期生存率可達70%以上，且多數無需維持治療，治療更徹底[2-3]。臨床數據顯示，影響SAA患者HSCT療效的主要因素有移植物抗宿主病、感染、出血等并發癥，而HSCT治療后中性粒細胞及血小板植活情況與上述并發癥發生或存在直接關系[4-5]。因此，早期預測HSCT療效不僅有助于積極完善干預策略提升患者獲益率，改善生存狀況，且利于節約醫療資源，減輕社會及家庭負擔。B淋巴細胞瘤-2(BCL-2)蛋白、Bcl-2相關X蛋白(Bax蛋白)是一對與細胞凋亡平衡有關蛋白，多項研究顯示，BCL-2/Bax與骨髓造血功能有關[6-7]。信號淋巴細胞激活分子家族6(SLAMF6)主要在NK、T、B等免疫細胞中表達，其主要有負調控自身免疫功能的作用[8]。EISENBERG等[9]研究顯示，SLAMF6可通過激活CD8+T淋巴細胞而參與腫瘤免疫的生物學過程。CD8+T淋巴細胞作為SAA的重要效應細胞，SLAMF6的異常表達是否與SAA患者HSCT療效有關尚無定論。本研究通過探討SAA患者HSCT治療前后外周血CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量、BCL-2/Bax變化，旨在為臨床完善HSCT療效評估機制提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年3月至2020年10月于本院接受HSCT治療的SAA患者56例納入研究。納入標準：(1)符合SAA診斷標準[10]，至少滿足以下項目中的2項，①網織紅細胞<1%，絕對計數<15×109個/L，②中性粒細胞絕對計數<0.5×109個/L；③血小板<2×109個/L；(2)無其他血液疾病及免疫性疾病；(3)對本研究內容知情同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)入組前1周內有免疫調節劑、皮質類固醇激素用藥史；(2)妊娠；(3)有嚴重肝腎心功能障礙；(4)有肺部等活動性感染。

1.2方法

1.2.1HSCT治療 患者入院完善對應檢查，明確是否有HSCT禁忌證及適應證。預處理：兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白[enzyme Europe B.V.，S20150035，規格：25毫克/瓶(每瓶含兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白25 mg,復溶后體積5 mL)，3.5 mg/(kg·d)，連續5 d]+氟達拉濱(江蘇奧賽康藥業有限公司，國藥準字H20064228，規格：50 mg，30 mg/m2，連續5 d)+環磷酰胺[江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字H32020857，規格：0.2 g，60 mg/(kg·d)，連續2 d]。移植物抗宿主病防范：全相合移植者予以環孢素A+短程甲氨蝶呤。造血干細胞動員、采集、回輸：供者皮下注射粒細胞集落刺激因子(G-CSF)300 μg/d，連續4 d，第5天采集骨髓回輸，次日COBE血細胞單采機[埃克森(北京)科技有限公司]分離外周干細胞，回輸。移植前2周，靜滴更昔洛韋預防巨細胞病毒感染，予以肝保護藥物預防肝靜脈阻塞綜合征，移植前1 d予以抗感染預防性治療，移植后的白細胞低谷期服用立康唑片，移植后7～10 d靜脈用丙種球蛋白。定期檢測巨細胞病毒感染，予以靜脈營養及對癥支持治療等。HSCT后1年內每隔3個月全面體檢1次。HSCT療效評價：中性粒細胞植活標準為首次連續3 d中性粒細胞絕對值>0.5×109/L；血小板植活標準為脫離血小板輸入，且連續7 d血小板計數>20×109/L。

1.2.2指標檢測 (1)外周血CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量：采用肝素抗凝真空管采集肘靜脈4 mL。實驗管加特異性抗體鼠抗人CD3-APC、CD8-FITC、SLAMF6-PE分別5 μL，同時對照管加特異性抗體鼠抗人CD3-APC、CD8-FITC及同型對照抗體PE-IgG1分別5 μL，每管加所采集外周血標本100 μL，混勻，孵育15 min(4 ℃避光)，加溶血素1 mL，室溫避光溶解紅細胞(8 min)，離心，棄上清，PBS洗2次，上機測SLAMF6表達量。(2)BCL-2/Bax：非抗凝真空管采集肘靜脈血4 mL，離心10 min(9 000×g)，取上清，孵育2 h(37 ℃)，加BCL-2、Bax抗體，孵育2 h(37 ℃)，加底物，孵育30 min(37 ℃)，測吸光度(A)值，標準曲線下獲得BCL-2、Bax水平，然后計算BCL-2/Bax。

1.3觀察指標 (1)HSCT后隨訪1年評價療效，包括中性粒細胞植活時間、血小板植活時間及并發癥發生率。(2)不同療效患者外周血CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量、BCL-2/Bax水平。(3)分析外周血CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量、BCL-2/Bax水平與中性粒細胞植活時間、血小板植活時間的相關性。(4)比較不同類型患者的中性粒細胞植活時間、血小板植活時間。(5)采用多元線性回歸分析中性粒細胞植活時間、血小板植活時間的影響因素，并建立回歸方程。

2 結 果

2.1HSCT治療效果分析 56例SAA患者經HSCT治療，中性粒細胞植活時間8～23 d，平均(15.38±3.76)d；血小板植活時間7～173 d，平均(89.65±22.64)d。27例患者HSCT治療后1年內出現移植物抗宿主病，發生率48.21%，其中Ⅰ度14例(51.85%)，Ⅱ度9例(33.33%)，Ⅲ度4例(14.81%)。感染16例，發生率28.57%，出血9例，發生率16.07%。無病死病例。以中性粒細胞植活時間、血小板植活時間均值為界，高于均值的患者移植物抗宿主病、感染并發癥發生率更低(P<0.05)。見表1。

表1 HSCT治療效果分析

2.2不同HSCT治療效果的患者外周血CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量、BCL-2/Bax水平比較 56例SAA患者經檢測發現，外周血CD8+T淋巴細胞SLAMF6的表達量為(58.02±11.87)%，BCL-2水平為(0.42±0.10)μg/L，Bax水平為(0.37±0.08)μg/L，BCL-2/Bax為1.14±0.28。中性粒細胞植活時間、血小板植活時間高于均值的患者外周血CD8+T淋巴細胞SLAMF6的表達量和血清BCL-2水平、BCL-2/Bax較低，Bax水平較高(P<0.05)。見表2。

表2 不同HSCT治療效果患者外周血CD8+ T淋巴細胞SLAMF6表達量、BCL-2/Bax水平比較

2.3外周血CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量、BCL-2/Bax水平與中性粒細胞植活時間、血小板植活時間相關性 外周血CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量與中性粒細胞植活時間、血小板植活時間呈負相關(r=-0.803、-0.707，均P<0.001)；BCL-2/Bax與中性粒細胞植活時間、血小板植活時間呈負相關(r=-0.802、-0.680，均P<0.001)，見圖1～4。

圖1 SLAMF6與中性粒細胞植活時間的關系

圖2 BCL-2/Bax與中性粒細胞植活時間的關系

2.4不同類型患者中性粒細胞植活時間、血小板植活時間比較 有主要臟器功能不全、移植物抗宿主病及CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量、BCL-2/Bax水平較高者中性粒細胞植活時間、血小板植活時間更長(P<0.05)。見表3。

表3 不同類型患者的中性粒細胞植活時間、血小板植活時間比較

2.5多元線性回歸分析 經多元線性回歸分析，篩選出與中性粒細胞植活時間、血小板植活時間有線性關系的因素：CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量、BCL-2/Bax對應的線性系數差異有統計學意義(P<0.05)。建立中性粒細胞植活時間回歸模型：中性粒細胞植活時間=35.807-0.325×SLAMF6-1.255×BCL-2/Bax，回歸模型具有統計學意義(F=102.31，P<0.001)，自變量可解釋中性粒細胞植活時間89.2%(R2=0.894，調整R2=0.892)的變異量。建立血小板植活時間回歸模型：血小板植活時間=67.220-2.999×SLAMF6-19.704×BCL-2/Bax，回歸模型具有統計學意義(F=185.04，P<0.001)，自變量可解釋血小板植活時間92.5%(R2=0.927，調整R2=0.925)的變異量。見表4、圖5～6。

圖3 SLAMF6與血小板植活時間的關系

圖4 BCL-2/Bax與血小板植活時間的關系

續表3 不同類型患者的中性粒細胞植活時間、血小板植活時間比較

表4 多元線性回歸分析

圖5 中性粒細胞植活時間實際值與預測值

3 討 論

HSCT是當前重建SAA患者骨髓造血功能，確保患者能長期生存的主要手段。盡管HSCT前已有標準預處理方案，但不同SAA患者HSCT效果不盡相同，如中性粒細胞及血小板植活時間存在差異[11]。本研究也發現，HSCT治療效果不盡相同，尤其是血小板植活時間最長近6個月，而中性粒細胞及血小板植活時間越短的患者并發癥發生率越低，患者獲益更大。此與近年研究結論一致[12]。因此，有效評估SAA患者HSCT治療的時效性對指導臨床積極完善干預策略至關重要。

目前SAA致病機制尚未完全明確。多數報道表明，此疾病的發生、發展可能與自身免疫所致造血干細胞損傷有關[13-14]。同時機體移植排斥反應也是HSCT能否成功的主要決定因素[15]。由此可見，機體免疫相關調控機制或與HSCT后中性粒細胞植活時間、血小板植活時間有關。SLAMF6是表達在淋巴細胞表面的一種跨膜糖蛋白受體，對淋巴細胞分化、功能具有調節作用，其參與系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發病過程[16]。有研究通過基因敲除技術證實，SLAMF6-/-小鼠Th1類細胞因子增加，而Th1類細胞因子缺失，并得出SLAMF6可能在機體免疫中發揮負調控作用[17-18]。本研究發現，中性粒細胞及血小板植活時間較長患者外周血SLAMF6呈低表達狀態。據此推測，SLAMF6低表達可能會造成機體免疫過度而影響中性粒細胞及血小板順利植入。分析原因，主要是造血干細胞作為移植物進入機體后可激發機體免疫排斥反應，而SLAMF6低表達可直接造成Th1/Th2平衡偏移，并引起Th1細胞過度增殖及生成、釋放白細胞介素-2、γ干擾素等多種細胞因子，加重造血干細胞免疫損傷。另外，研究顯示，初治SAA患者外周血CD8+T淋巴細胞表面SLAMF6低表達，而CD8+T淋巴細胞及其效應因子水平顯著升高[19]。據此認為，SLAMF6低表達可能會造成“殺手”CD8+T淋巴細胞過度激活而增加中性粒細胞及血小板植活難度。相關性分析發現，SLAMF6表達與中性粒細胞及血小板植活時間呈負相關，且是二者植活時間的獨立因素，說明SLAMF6或可作為臨床評估HSCT療效的客觀依據。

BCL-2/Bax決定細胞“命運”。研究顯示，BCL-2/Bax水平升高預示細胞生命延長，否則細胞凋亡加速[20]。廖亮英等[21]研究顯示，可通過調節BCL-2、Bax表達而促進神經干細胞移植大鼠神經功能恢復。本研究發現，BCL-2/Bax值低時，SAA患者中性粒細胞及血小板植活時間延長，提示BCL-2/Bax值可能與HSCT療效有關。但有研究指出，中性粒細胞及血小板植活情況是多因素作用的結果，如移植前巨細胞病毒血癥、營養狀態均是其影響因素[22-23]。本研究也發現，移植物抗宿主病與HSCT療效有關，但校正混雜因素后，僅SLAMF6、BCL-2/Bax進入方程，提示SLAMF6、BCL-2/Bax是HSCT療效的獨立因素。分析可能的原因：(1)BCL-2能抑制細胞程序性凋亡，參與細胞線粒體、核孔復合體信號傳遞，且能通過改變線粒體外膜通透性而調節促細胞凋亡因子的釋放，而Bax作為BCL-2蛋白家族主要成員之一，是一種促細胞凋亡蛋白。因此，BCL-2/Bax值降低時可能會造成新植入造血干細胞增殖、分化受影響，以致中性粒細胞及血小板植活時間延長。(2)研究證實，SAA患者血超氧化物歧化酶、過氧化氫酶水平呈異常狀態，氧化應激參與此疾病發生發展過程[24]。BCL-2是一種重要抗氧化劑，可調節機體內環境氧化還原狀態，減輕或阻斷細胞及其組分被氧化損傷，而BCL-2低水平狀態或直接造成造血干細胞受氧化應激誘導而衰老。上述研究表明，BCL-2/Bax水平與HSCT療效關系密切。后續分析發現，CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量、BCL-2/Bax水平可解釋中性粒細胞植活時間及血小板植活時間的變異量均達89%以上，說明SLAMF6、BCL-2/Bax可為臨床評估HSCT療效提供客觀依據。但HSCT治療后病情轉歸復雜，除與患者原生免疫系統有關外，還與供者干細胞分化及增殖而來的中性粒細胞有關，當其將自身組織作為“異物”產生免疫排斥時亦會影響HSCT整體效果，而患者CD8+T淋巴細胞SLAMF6表達量、BCL-2/Bax水平是否與此免疫反應強度有關仍需繼續探討。

綜上可知，SAA患者SLAMF6與BCL-2/Bax表達下調會延長HSCT治療后中性粒細胞植活時間、血小板植活時間，二者可作為預測HSCT療效的指標。