艾拉莫德通過TLR4/NF-κB通路抑制骨關節炎軟骨細胞模型凋亡及炎癥反應*

鄧 麗，文振華，田 鋒，姚芳玲

株洲市中心醫院風濕免疫科，湖南株洲 412000

骨關節炎(OA)是一類以關節軟骨退行性改變以及繼發性骨質增生、骨贅形成為特征的慢性骨關節疾病，主要的臨床癥狀是關節疼痛和活動受限，嚴重者會發展為關節畸形。目前，OA主要的保守治療方法是使用非甾體類藥物進行抗炎和鎮痛，尚缺乏逆轉關節軟骨損害的特異性手段[1-2]。艾拉莫德是一種新型的抗風濕小分子藥物，具有抑制炎癥、調節免疫的生物學功能，臨床上用于類風濕關節炎的治療能夠有效抑制關節滑膜中炎癥反應及細胞凋亡的激活[3]。在OA的發病過程中，關節軟骨細胞炎癥反應及細胞凋亡的異常激活是造成軟骨退行性改變重要的生物學因素[4]，國內一項基礎研究報道艾拉莫德對白細胞介素(IL)-1β誘導的關節軟骨細胞基質水解具有改善作用[5]，但該藥物是否直接改善OA發病過程中關節軟骨細胞的炎癥反應及細胞凋亡尚不清楚。因此，本研究將以IL-1β刺激關節軟骨細胞的方式建立OA細胞模型，具體觀察艾拉莫德對OA細胞模型凋亡及炎癥反應的調控作用及分子機制，旨在為發現OA治療的新藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1細胞株 小鼠軟骨細胞株ATDC5購自美國ATCC公司。

1.2儀器與試劑 細胞培養箱購自英國Herocell公司，多功能酶標儀購自美國ABI公司，顯微鏡為日本奧林巴斯公司產品，凝膠電泳儀及成像儀均為上海天能公司產品。達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)及胎牛血清均購自美國Gibco公司，艾拉莫德片購自海南先聲藥業有限公司，CCK8細胞增殖檢測試劑盒購自美國MCE公司，IL-1β購自美國Sigma公司，pcDNA質粒、pcDNA-TLR4質粒購自上海生工公司，TUNEL細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天公司，細胞因子的酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自上海西唐公司，兔抗小鼠裂解型caspase-3(Cleaved caspase-3)、Toll樣受體4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)p-p65、β-actin特異性一抗及山羊抗兔辣根過氧化物酶二抗購自美國Abcam公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養 ATDC5細胞在含有10%胎牛血清的培養基中貼壁培養，每2 d更換1次培養基，當細胞密度生長至80%～90%時進行胰蛋白酶消化并按照1∶3的比例傳代繼續培養。

1.3.2細胞分組 傳代的ATDC5細胞接種在培養板內進行分組，對照組用不含藥物的培養基處理，模型組用含有10 ng/mL IL-1β的培養基處理，不同濃度艾拉莫德組用含有10 ng/mL IL-1β及不同濃度(0.6、1.2、1.8 mg/L)艾拉莫德處理；pcDNA對照組轉染pcDNA質粒，pcDNA模型組在含有10 ng/mL IL-1β的培養基中轉染pcDNA質粒，pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組在含有10 ng/mL IL-1β及1.8 mg/L艾拉莫德的培養基中轉染pcDNA質粒，pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組在含有10 ng/mL IL-1β及1.8 mg/L艾拉莫德的培養基中轉染pcDNA-TLR4質粒。轉染均采用脂質體法。每組做4個復孔，均連續給藥或轉染48 h。

1.3.3CCK8法檢測細胞增殖活力 收集細胞，采用CCK8法進行細胞增殖的檢測，每孔加入10 μL試劑盒檢測液，繼續培養2 h后在酶標儀上檢測A490，并以A490表示細胞增殖活力。

1.3.4TUNEL法檢測細胞凋亡 收集細胞，用4%多聚甲醛固定后進行TUNEL法檢測，先加入TUNEL染液進行染色，漂洗后加入DAPI染液進行染色，最后用抗熒光猝滅封片液封片后在顯微鏡下隨機觀察5個高倍視野，對TUNEL陽性細胞和DAPI陽性細胞進行計數，計算細胞凋亡率=TUNEL陽性細胞數/DAPI陽性細胞數×100%。

1.3.5ELISA檢測細胞因子水平 收集細胞培養基，采用ELISA試劑盒檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-8的水平。操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.6免疫印跡法檢測蛋白表達水平 收集細胞，加入裂解液、裂解細胞、提取蛋白，檢測蛋白濃度后將含有20 μg蛋白的樣本加入聚丙烯酰胺凝膠，進行垂直電泳及水平電轉膜；取電轉后的硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后Cleaved caspase-3、TLR4、NF-κB p-p65特異性一抗4 ℃孵育過夜；次日孵育二抗后在凝膠成像儀中進行ECL顯影，得到蛋白條帶并掃描灰度值，以β-actin為內參，計算Cleaved caspase-3、TLR4、NF-κB p-p65的表達水平。

2 結 果

2.1艾拉莫德對OA軟骨細胞模型凋亡水平的影響 與對照組比較，模型組A490降低、凋亡率增加(P<0.05)；與模型組比較，不同濃度艾拉莫德組A490升高、凋亡率降低(P<0.05)且艾拉莫德調節增殖活力凋亡的作用呈濃度依賴。TUNEL染色見圖1，A490及凋亡率的比較見表1。

表1 對照組、模型組、不同濃度艾拉莫德組A490及凋亡率的比較

注：A為對照組；B為模型組：C為0.6 mg/L艾拉莫德組；D為1.2 mg/L艾拉莫德組；E為1.8 mg/L艾拉莫德組。

2.2艾拉莫德對OA軟骨細胞模型凋亡基因表達的影響 與對照組比較，模型組Cleaved caspase-3的表達水平增加(P<0.05)；與模型組比較，不同濃度艾拉莫德組Cleaved caspase-3的表達水平降低(P<0.05)且艾拉莫德調節Cleaved caspase-3表達的作用呈濃度依賴,見圖2。

注：A為對照組；B為模型組；C為0.6 mg/L艾拉莫德組；D為1.2 mg/L艾拉莫德組；E為1.8 mg/L艾拉莫德組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3艾拉莫德對OA軟骨細胞模型炎癥反應的影響 與對照組比較，OA模型組TNF-α、IL-6、IL-8水平增加(P<0.05)；與OA組比較，不同濃度艾拉莫德組組TNF-α、IL-6、IL-8水平降低(P<0.05)且艾拉莫德調節組TNF-α、IL-6、IL-8水平的作用呈濃度依賴。見表2。

表2 對照組、模型組、不同濃度艾拉莫德組TNF-α、IL-6、IL-8水平比較

2.4艾拉莫德對OA軟骨細胞模型TLR4、NF-κB p-p65表達的影響 與對照組比較，模型組TLR4、NF-κB p-p65的表達水平增加(P<0.05)；與OA組比較，不同濃度艾拉莫德組TLR4、NF-κB p-p65的表達水平降低(P<0.05)且艾拉莫德調節TLR4、NF-κB p-p65表達的作用呈濃度依賴。見圖3。

注：A為對照組；B為模型組；C為0.6 mg/L艾拉莫德組；D為1.2 mg/L艾拉莫德組；E為1.8 mg/L艾拉莫德組；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.5過表達TLR4對艾拉莫德抑制OA軟骨細胞模型TLR4、NF-κB p-p65表達的影響 與pcDNA對照組比較，pcDNA模型組中TLR4、NF-κB p-p65的表達水平增加(P<0.05)；與pcDNA模型組比較，pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組中TLR4、NF-κB p-p65的表達水平降低(P<0.05)；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組中TLR4、NF-κB p-p65的表達水平增加(P<0.05)。見圖4。

注：A為pcDNA對照組；B為pcDNA模型組；C為pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組；D為pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組；與pcDNA對照組比較，*P<0.05；與pcDNA模型組比較，#P<0.05；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，△P<0.05。

2.6過表達TLR4對艾拉莫德降低OA軟骨細胞模型凋亡水平的影響 與pcDNA對照組比較，pcDNA模型組A490降低、凋亡率增加(P<0.05)；與pcDNA模型組比較，pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組增殖活力A490增加、凋亡率降低(P<0.05)；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組增殖活力A490降低、凋亡率增加(P<0.05)。TUNEL染色見圖5，A490及凋亡率的比較見表3。

注：A為pcDNA對照組；B為pcDNA模型組；C為pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組；D為pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組。

表3 各組細胞A490及凋亡率的比較

2.7過表達TLR4對艾拉莫德抑制OA軟骨細胞模型凋亡基因表達的影響 與pcDNA對照組比較，pcDNA模型組中cleaved caspase-3的表達水平增加(P<0.05)；與pcDNA模型組比較，pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組中cleaved caspase-3的表達水平降低(P<0.05)；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組中cleaved caspase-3的表達水平增加(P<0.05)。見圖6。

注：A為pcDNA對照組；B為pcDNA模型組；C為pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組；D為pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組。與pcDNA對照組比較，*P<0.05；與pcDNA模型組比較，#P<0.05；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，△P<0.05。

2.8過表達TLR4對艾拉莫德抑制OA軟骨細胞模型炎癥反應的影響 與pcDNA對照組比較，pcDNA模型組TNF-α、IL-6、IL-8的水平增加(P<0.05)；與pcDNA模型組比較，pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組TNF-α、IL-6、IL-8的水平增加降低(P<0.05)；與pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德組比較，pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德組TNF-α、IL-6、IL-8的水平增加(P<0.05)。見表4。

表4 各組細胞TNF-α、IL-6、IL-8水平比較

3 討 論

軟骨細胞是關節軟骨內合成軟骨基質的唯一細胞，對于維持軟骨正常的結構和功能具有重要意義。軟骨細胞在慢性炎癥、機械應力的刺激下發生損傷會導致關節軟骨基質降解并逐步出現軟骨退行性改變、繼發性骨質增生和骨贅形成等OA特征性改變。因此，保護關節軟骨細胞是治療OA的關鍵。但目前常用的非甾體類藥物、氨基葡萄糖、硫酸軟骨素等藥物雖然能夠起到抗炎鎮痛、促進軟骨基質修復的作用，但無法直接保護軟骨細胞、逆轉軟骨退行性變的作用，尋找新的OA治療藥物及手段具有迫切的臨床需求。

艾拉莫德是一種新型的類風濕關節炎治療藥物，具有抑制炎癥及免疫調節活性，相關的細胞實驗證實該藥物用于處理類風濕關節炎滑膜細胞能夠抑制炎癥反應和細胞凋亡[6-7]。近些年，陸續有學者報道了艾拉莫德用于OA治療的價值。雖然該藥品目前未獲得治療OA的適應證，但國內一項隨機對照研究將艾拉莫德用于OA治療，結果證實艾拉莫德顯著減輕疼痛、改善關節功能、抑制炎癥反應[8]；另一項細胞實驗證實艾拉莫德對OA軟骨細胞模型的細胞基質降解具有抑制作用[5]，提示艾拉莫德可能通過延緩或逆轉關節軟骨退行性改變的途徑發揮OA治療價值，但目前關于艾拉莫德對OA發病過程中軟骨細胞的保護作用尚缺乏直接證據，這也使艾拉莫德用于OA治療缺乏足夠的基礎研究證據。

本研究設計了細胞實驗，采用與既往其他學者相同的10 ng/mL IL-1β刺激的方式建立OA軟骨細胞模型并給予艾拉莫德干預[9-10]。OA軟骨細胞模型出現了細胞凋亡和炎癥反應的激活，表現為增殖活力降低，凋亡率及凋亡基因Cleaved caspase-3表達水平、多種炎癥細胞因子水平增加，符合OA的特征。經艾拉莫德干預后，OA軟骨細胞模型的細胞凋亡和炎癥反應均受到抑制，細胞的增殖活力增加，凋亡率及凋亡基因Cleaved caspase-3表達水平、多種炎癥細胞因子水平均降低。以上結果表明艾拉莫德對OA軟骨細胞模型的炎癥反應和細胞凋亡具有抑制作用，這也為艾拉莫德治療OA發揮軟骨保護作用提供了直接的細胞實驗證據，也為今后使用艾拉莫德治療OA積累了基礎研究資料。

艾拉莫德目前的適應證是用于類風濕關節炎的治療，多項相關的基礎研究證實艾拉莫德減輕滑膜組織炎癥反應的作用與抑制TLR4/NF-κB通路的激活有關[11-12]。OA的發生、發展同樣涉及TLR4/NF-κB通路的激活，該通路的激活顯著促進軟骨細胞的凋亡及炎癥反應[13-15]。本研究使用艾拉莫德對OA軟骨細胞模型進行干預后TLR4及NF-κB p-p65的表達水平均明顯降低，提示艾拉莫德在OA治療過程中可能抑制軟骨細胞的TLR4/NF-κB通路。進一步設計拯救實驗，在艾拉莫德處理的同時通過轉染pcDNA-TLR4質粒的方式增加TLR4及NF-κB p-p65的表達后，艾拉莫德減輕OA軟骨細胞模型細胞凋亡和炎癥反應的作用被逆轉，表明艾拉莫德通過抑制TLR4/NF-κB通路減輕OA軟骨細胞模型細胞凋亡和炎癥反應，這為深入認識艾拉莫德發揮OA治療價值的分子機制積累了實驗數據。

綜上所述，在10 ng/mL IL-1β刺激所建立的OA軟骨細胞模型中，給予艾拉莫德干預能夠減輕凋亡及炎癥反應，這一作用與抑制TLR4/NF-κB通路有關，這為今后使用艾拉莫德治療OA、研究艾拉莫德的分子藥理機制積累了細胞實驗數據。TLR4下游包括MyD88依賴途徑和非MyD88依賴途徑，本文初步揭示了艾拉莫德抗炎及抗凋亡的作用與抑制TLR4/NF-κB通路有關，但具體對MyD88依賴途徑和非MyD88依賴途徑調控作用尚不清楚，今后應進一步探討TLR4下游不同途徑在艾拉莫德抗炎及抗凋亡中的作用。