沙棘多糖對腦膠質瘤大鼠的抑瘤作用及對HMGB1、MGMT及TLR4表達的影響

徐大偉，刁玉領，惠 磊，周文科，汲乾坤

腦膠質瘤由大腦和脊髓膠質細胞癌變所產生，約占所有原發性顱腦腫瘤的51.4%，呈現細胞異常增殖、快速彌漫性浸潤和抗凋亡的侵襲性特征，影響腦組織功能，對病人生命健康及生活質量造成極大威脅[1-2]。目前腦膠質瘤的臨床治療主要依靠外科手術，并輔以新的放療(適形、調強放療)和藥物化療，但病人生存率仍然較低。因此，開發安全有效的藥物對提高病人生存質量具有重要意義。沙棘的漿果是傳統藥用食品，具有活血散瘀、化痰寬胸、補脾健胃、清熱止瀉、緩解疼痛等功效，在腫瘤預防治療、增強免疫、抗炎、抗衰老等方面具有明顯效果[3-4]。沙棘多糖(hippophae rhamnoides polysaccharide，HRP)是從沙棘果中提取的一種多糖類物質，具有抑菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、防衰老以及肝臟保護等作用[5]。目前，HRP對腦膠質瘤的藥理活性及作用機制研究較少，本研究擬通過建立腦膠質瘤大鼠模型，探討HRP的抑瘤作用及可能機制，為HRP類藥物的研究和腦膠質瘤的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和實驗動物 大鼠C6腦膠質瘤細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠60只，7周齡，體質量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011]。購入后在SPF環境中適應性飼養1周。

1.1.2 主要試劑和儀器 HRP(純度>90%)購自上海詩丹德標準技術服務有限公司；替莫唑胺購自北京嘉瑞時代科技有限公司；兔抗大鼠高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)一抗、O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT)一抗、Toll樣受體4(Toll-like Receptor 4，TLR4)一抗購自美國Thermo Fisher Scientific公司，小鼠抗大鼠β-actin一抗購自美國Santa Cruz公司，HRP標記的羊抗兔二抗、HRP標記羊抗鼠二抗購自英國Abcam公司；磁共振成像(MRI)掃描儀(MiniMR-60實驗動物核磁共振成像儀)購自上海紐邁電子科技有限公司；流式細胞儀購自美國BD公司；蛋白凝膠電泳儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠C6腦膠質瘤細胞培養 復蘇大鼠C6腦膠質瘤細胞，加入體積分數10%滅活新生胎牛血清的RPMI-1640培養基(含NaHCO32 g/L，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL)中，將培養瓶置于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕密閉細胞培養箱中培養，采用單層培養法傳代。取10 μL對數生長期C6細胞，苔盼藍排斥實驗檢測細胞活力>95%。用紅細胞計數板光鏡下計數，調節濃度至每10 μL含1×106個細胞。

1.2.2 建立大鼠腦膠質瘤模型 取60只SD大鼠，用1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，大鼠腦立體定向儀頭架固定頭部，兩耳針深入外耳道，剪去頭頂部毛發，消毒后鋪洞巾。頭頂雙側眼裂連線后約1.5 cm處橫向剪開頭皮，逐層暴露至顱骨，確定前囟位置。囟中點前1 mm，矢狀縫右側旁開3.0～3.5 mm，接種部位為大鼠右側尾狀核，自接種點垂直進針，從接觸硬膜開始計算，進針深度約6 mm，后退1 mm，10 min內將10 μL細胞懸液(含有約1.0×106個C6細胞)緩慢注入腦組織，注射完畢留針5 min，緩慢退針，用骨蠟封閉骨孔，逐層縫合頭皮切口。給予3 d含抗生素的飲用水預防感染。接種后10 d，行強化頭部MRI，確定是否有腫瘤形成。

1.2.3 分組及藥物干預 有3只大鼠在造模過程中死亡，將造模成功的57只大鼠隨機分為模型組(15只)、HRP低劑量組(14只)、HRP高劑量組(14只)、替莫唑胺組(14只)。HRP低劑量組、HRP高劑量組分別給予HRP 100 mg/kg、200 mg/kg，用生理鹽水溶解后灌胃，每日1次，連續給藥10 d；替莫唑胺組給予替莫唑胺 20 mg/kg，用生理鹽水溶解后灌胃，每日1次，連續給藥10d；在實驗期間模型組灌胃相同體積的生理鹽水。

1.2.4 大鼠腦膠質瘤體積及抑瘤率測算 治療結束24 h后，對每組大鼠進行頭顱MRI檢查，測量腫瘤長短徑，按照公式計算各組腫瘤體積及抑瘤率。腫瘤體積=a×b2/2(a為測量的腫瘤長徑，b為腫瘤短徑)；抑瘤率=(模型組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/模型組腫瘤體積×100%，抑瘤率≥30%為腫瘤對藥物敏感。

1.2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察大鼠腦膠質瘤形態學變化 斷頭處死大鼠，分離大腦，沿移植C6細胞的進針點做冠狀切口，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片(厚度約為3 μm)，二甲苯脫蠟，蘇木精、伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察腫瘤細胞數量、密度及壞死等形態學變化。

1.2.6 流式細胞儀檢測腫瘤組織細胞凋亡和細胞周期 每組取3只大鼠，取出大鼠腦膠質瘤組織，剪碎，300目尼龍濾網過濾，制備腫瘤單細胞懸液，1 000 r/min(離心半徑10 cm)離心5 min，棄上清，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗，調整細胞濃度至1×106個/mL，乙醇4 ℃固定18 h，離心棄上清，PBS重懸，加入RNA酶(Rnase)碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液37 ℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡率和細胞周期。數據用CellQuest軟件進行分析。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測腫瘤組織中HMGB1、MGMT和TLR4 mRNA水平 取60 mg腦膠質瘤組織，加入液氮研磨，按照Trizol試劑說明書提取RNA，超微量分光光度計測定RNA濃度及A260/280。反轉錄cDNA，配制PCR反應體系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，2.5 μmol/L正向、反向引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL；反應程序：95 ℃預變性60 s；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，45 s，共循環40次。待測基因PCR引物使用Primer 3.0設計，引物序列見表1。

表1 待測基因名稱及引物序列

1.2.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測腫瘤組織中HMGB1、MGMT和TLR4蛋白表達 取100 mg腦膠質瘤組織，液氮研磨，加入裂解液裂解，勻漿液4 ℃，10 000 r/min離心15 min，取上清即為蛋白樣品。二喹啉甲酸(BCA)法測定總蛋白濃度，加入電泳上樣緩沖液后100 ℃金屬浴加熱5 min使蛋白變性，10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳，電泳結束后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用HMGB1一抗(1∶1 000)、MGMT一抗(1∶1000)、TLR4一抗(1∶125)、β-Actin一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。加入1∶2 000稀釋的HRP標記的二抗中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加入增強型化學發光試劑(ECL)化學發光液，暗室曝光顯影，使用Image J軟件進行蛋白條帶灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠腫瘤體積和抑瘤率比較 各組腫瘤體積、抑瘤率組間比較，差異有統計學意義(P<0.001)。與模型組比較，HRP低劑量組、HRP高劑量組、替莫唑胺組腫瘤體積減小(P<0.05)；與HRP低劑量組比較，HRP高劑量組、替莫唑胺組腫瘤體積減小(P<0.05)，抑瘤率升高(P<0.05)；與HRP高劑量組比較，替莫唑胺組抑瘤率降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腫瘤體積和抑瘤率比較(±s)

P<0.05；與HRP高劑量組比較，③P<0.05。

2.2 HE染色觀察 HE染色顯示，模型組腦膠質瘤內腫瘤細胞生長活躍，數量豐富，排列密集，核大深染，腫瘤細胞異型性明顯，核漿比例高，核分裂現象多見，呈浸潤性生長，無明顯細胞萎縮壞死現象；HRP低劑量組細胞數量較模型組減少，細胞生長密度降低，有部分壞死；HRP高劑量組可見凋亡細胞，數量明顯減少，生長密度降低，細胞體積變小，細胞核形態相對規則，出現萎縮、柵欄狀壞死現象；替莫唑胺組較模型組、HRP低劑量組細胞數量減少，但較HRP高劑量組多，可見少量萎縮壞死細胞。詳見圖1。

圖1 各組腫瘤組織HE染色結果(×200) (A為模型組；B為HRP低劑量組；C為HRP高劑量組；D為替莫唑胺組)

2.3 各組大鼠腫瘤組織細胞凋亡和細胞周期 各組Sub-G1期、G0/G1期、S期與G2/M期細胞及凋亡率組間比較，差異均有統計學意義(P<0.001)。與模型組比較，HRP低劑量組、HRP高劑量組和替莫唑胺組Sub-G1期、G0/G1期細胞增加，S期、G2/M期細胞減少，凋亡率升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與HRP低劑量組比較，HRP高劑量組和替莫唑胺組Sub-G1期、G0/G1期細胞增加，S期、G2/M期細胞減少，凋亡率升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與HRP高劑量組比較，替莫唑胺組Sub-G1期、G0/G1期細胞減少，S期、G2/M期細胞增加，凋亡率降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠腫瘤組織細胞周期和細胞凋亡率比較(±s) 單位：%

2.4 各組大鼠腫瘤組織中HMGB1、MGMT和TLR4 mRNA水平比較 各組腫瘤組織中HMGB1、MGMT和TLR4 mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.001)。與模型組比較，HRP低劑量組、HRP高劑量組和替莫唑胺組HMGB1、MGMT和TLR4 mRNA相對表達量均降低(P<0.05)；與HRP低劑量組比較，HRP高劑量組、替莫唑胺組HMGB1、MGMT和TLR4 mRNA相對表達量均降低(P<0.05)；與HRP高劑量組比較，替莫唑胺組HMGB1、MGMT和TLR4 mRNA相對表達量均升高(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠腫瘤組織HMGB1、MGMT、TLR4 mRNA表達水平比較(±s)

2.5 各組大鼠腫瘤組織中HMGB1、MGMT和TLR4蛋白表達水平 各組腫瘤組織中HMGB1、MGMT和TLR4蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.001)。與模型組比較，HRP低劑量組、HRP高劑量組及替莫唑胺組HMGB1、MGMT和TLR4蛋白相對表達量均降低(P<0.05)；與HRP低劑量組比較，HRP高劑量組和替莫唑胺組HMGB1、MGMT和TLR4 蛋白相對表達量均降低(P<0.05)；與HRP高劑量組比較，替莫唑胺組HMGB1、MGMT和TLR4蛋白相對表達量均升高(P<0.05)。詳見表5及圖2。

表5 各組腫瘤組織中HMGB1、MGMT和TLR4蛋白表達水平比較(±s)

圖2 各組腫瘤組織中HMGB1、MGMT和TLR4蛋白表達條帶圖(A為模型組；B為HRP低劑量組；C為HRP高劑量組；D為替莫唑胺組)

3 討 論

腦膠質瘤的發生率占顱內腫瘤的35%～60%，其總發病率達到5/10萬，死亡率高居癌癥前列，惡性腦膠質瘤病人平均壽命僅為14個月[6]。惡性膠質瘤呈浸潤性生長，邊界不清，手術難以大范圍徹底切除，導致其易復發，多數膠質瘤對放射線不敏感，化療藥物難以進入顱內，相當一部分腫瘤對抗癌藥物耐藥，且副作用大，導致臨床效果不理想。植物中的多糖成分副作用相對較小，臨床已被成功用于抗腫瘤治療[7-8]，多糖可通過阻滯細胞周期及誘導凋亡等途徑發揮抗腫瘤作用[9-10]。HRP的水解單糖含有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等，其抗腫瘤作用已被證實[11]。

C6大鼠腦膠質瘤模型操作簡便，成瘤率高，可重復性好，顱外遠隔部位轉移率低，與人腦膠質瘤病理特征相似。本研究將C6大鼠腦膠質瘤細胞接種于SD大鼠的右側尾狀核區，成功建立了腦膠質瘤動物模型。通過測量腫瘤體積及抑瘤率發現，經HRP、替莫唑胺干預后腫瘤體積較模型組明顯減小，抑瘤率均大于30%。其中，HRP高劑量組抑瘤率最高，達44.41%。對腫瘤組織進行病理學觀察及細胞周期與凋亡檢測發現，與模型組比較，HRP低劑量組、HRP高劑量組和替莫唑胺組細胞數量明顯減少，生長密度降低，細胞體積變小，出現萎縮、柵欄狀壞死現象；Sub-G1期、G0/G1期細胞增加，S期、G2/M期細胞減少，細胞凋亡率升高，提示HRP阻滯C6腦膠質瘤細胞周期G0/G1期，S期和G2/M期細胞減少代表凋亡的Sub-G1期出現，凋亡細胞增加，發揮抑瘤作用。Zhamanbaeva等[12]研究發現，沙棘葉提取物具有抑制人急性髓系白血病細胞增殖作用，誘導細胞周期阻滯和凋亡。Li等[13]研究發現，沙棘提取物異鼠李素誘導結腸癌細胞周期阻滯在G2/M期，增強了細胞周期蛋白B1的蛋白表達，從而抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡。本研究證實沙棘提取物HRP對腦膠質瘤細胞周期的阻滯作用。

HMGB1是一種非組蛋白染色質相關蛋白，參與DNA修復、重組、自噬、壞死和細胞凋亡等生物學過程[14]。HMGB1可以促使核酸內切酶激活，是凋亡小體的組成部分，通過轉錄依賴性途徑和轉錄非依賴性途徑調控細胞凋亡。HMGB1與受體RAGE、TLR4結合，激活下游信號通路，從而達到拮抗凋亡的效果[15]。Zhang等[16]研究發現，HMGB1可通過HMGB1-RAGE信號通路促進膠質瘤細胞增殖。Deng等[17]研究發現，HMGB1可與Toll樣受體結合促進膠質瘤細胞的侵襲和遷移發揮促瘤作用。MGMT可以修復腫瘤細胞的DNA烷基化損傷，表現為對烷化劑類抗腫瘤藥物的耐藥，所以抑制腫瘤細胞的MGMT基因表達和活性可逆轉其耐藥性。HRP是否通過抑制腫瘤細胞的HMGB1、TLR4表達對腦膠質瘤大鼠發揮抗腫瘤作用以及是否可以抑制MGMT基因表達實現逆轉其耐藥性方面未見報道。本研究建立腦膠質瘤大鼠模型，經HRP干預后檢測HMGB1、MGMT及TLR4的mRNA和蛋白表達水平，結果顯示，HRP可以下調HMGB1、MGMT及TLR4的mRNA和蛋白表達，提示HRP可能通過抑制腫瘤細胞HMGB1、TLR4、MGMT表達，促進細胞凋亡，發揮抑瘤作用。

綜上所述，HRP對腦膠質瘤大鼠具有明顯抑制腫瘤生長作用，可能與抑制HMBG1、TLR4、MGMT表達，阻滯細胞周期，促進細胞凋亡，為臨床治療腦膠質瘤提供實驗依據。