lncRNA SNHG8負(fù)調(diào)控miR-411-5p影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的機(jī)制研究

喬瑞君，鄭華月，陳中慧

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)是兒童較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。NB的治療方法主要有手術(shù)和化療，但治療效果不佳，嚴(yán)重影響病人身體健康[2]。NB的發(fā)生發(fā)展與多種基因的異常表達(dá)密切相關(guān)，探究NB異常表達(dá)的基因及其作用機(jī)制，可為該疾病的治療提供新靶點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類小分子非編碼RNA，均參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生命過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-4]。研究顯示，lncRNA可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA與miRNA結(jié)合，共同影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。小核仁RNA宿主基因8(SNHG8)是一種lncRNA，參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展。Song等[6]研究顯示，SNHG8在食管鱗癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)明顯升高，其高表達(dá)與病人的腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及總生存率密切相關(guān)，下調(diào)SNHG8表達(dá)，通過靶向miR-411抑制核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α2表達(dá)降低食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但目前，SNHG8在NB中的表達(dá)及其對(duì)NB細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響和機(jī)制尚未明確。Starbase在線生物軟件預(yù)測(cè)顯示，SNHG8可能與miR-411-5p靶向結(jié)合。研究顯示，miR-411-5p在肝細(xì)胞癌[7]和乳腺癌[8]等腫瘤組織或細(xì)胞系中呈低表達(dá)，其過表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，延緩腫瘤發(fā)展進(jìn)程。但目前，miR-411-5p對(duì)NB細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及SNHG8能否靶向調(diào)控miR-411-5p影響NB的發(fā)展進(jìn)程還未知。因此，本研究首先檢測(cè)NB組織和瘤旁組織中SNHG8和miR-411-5p的表達(dá)水平，并以SK-N-SH細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察SNHG8能否靶向調(diào)控miR-411-5p影響SK-N-SH細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲，以期為NB的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年5月—2019年12月于本院接受治療的31例NB患兒為研究對(duì)象，其中，男17例，女14例；年齡(4.68±1.59)歲；按照國(guó)際NB分期系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期10例，Ⅲ期16例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未進(jìn)行放療、化療等治療；術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為NB。手術(shù)采集患兒癌組織和對(duì)應(yīng)的瘤旁組織，液氮保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，病人家屬知情同意且自愿簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞和試劑 SK-N-SH細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hycolne公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司；Trizol試劑和LipofectamineTM 2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR引物、SNHG8小干擾RNA(si-SNHG8)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-411-5p模擬物(mimcs)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)、miR-411-5p抑制劑(anti-miR-411-5p)及抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Ki67、活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-Caspases-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)SNHG8和miR-411-5p表達(dá) Trizol試劑提取組織中總RNA，微量核酸儀檢測(cè)其濃度和純度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃10 min，95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列：SNHG8正向引物為5′-AGCGCAGTCAGGATATTGGT-3′，反向引物為5′-GCACAA GAGCGACAGAGTAG-3′；miR-411-5p正向引物為5′-CGTACGCTTTATCTGTGACG-3′，反向引物為5′-GTC AAGTCGGTGGAACG-3′；GAPDH正向引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物為5′-GG C TGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；U6正向引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。SNHG8以GAPDH為內(nèi)參，miR-411-5p以U6為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算SNHG8和miR-411-5p相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇SK-N-SH細(xì)胞，加入含10% FBS的 RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。2～3 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) PCR擴(kuò)增含miR-411-5p結(jié)合位點(diǎn)的SNHG8的3′UTR序列，同時(shí)利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變，均克隆至psi-CHECK-2載體，分別構(gòu)建SNHG8野生型質(zhì)粒(WT-SNHG8)和突變型質(zhì)粒(MUT-SNHG8)。分別將SNHG8-WT、SNHG8-MUT與miR-411-5pmimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞并裂解。參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明書，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SK-N-SH細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至60%時(shí)，更換為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別將si-SNHG8(si-SNHG8組)、si-NC(si-NC組)、si-SNHG8與anti-miR-411-5p(si-SNHG8+anti-miR-411-5p組)、si-SNHG8與anti-miR-NC(si-SNHG8+anti-miR-NC組)轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔0.5×104個(gè)細(xì)胞。同時(shí)將未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的SK-N-SH細(xì)胞設(shè)置為對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定光密度(OD)值。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞接種于24孔板中，每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.7 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 調(diào)整各組細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：首先在Transwell上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干后，加入100 μL細(xì)胞懸液，后續(xù)操作與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.3.8 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞接種于24孔板中，每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，行10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。電泳后，將分離蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，并于5%脫脂奶粉中封閉，時(shí)間1 h。分別置于Ki67、Cleaved-Caspases-3、MMP-2和MMP-9一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。置于山羊抗兔二抗孵育液中，37 ℃孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后，曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 NB組織與瘤旁組織中SNHG8和miR-411-5p表達(dá)水平比較 與瘤旁組織比較，NB組織SNHG8表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-411-5p表達(dá)水平降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 NB組織與瘤旁組織中SNHG8和miR-411-5p表達(dá)水平比較(±s)

2.2 SNHG8靶向負(fù)調(diào)控miR-411-5p Starbase在線生物軟件預(yù)測(cè)顯示，SNHG8可能與miR-411-5p靶向結(jié)合。與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-SNHG8的miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-SNHG8的miR-411-5p組熒光素酶活性降低(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染MUT-SNHG8的miR-NC組熒光素酶活性與miR-411-5p組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組、si-NC組比較，si-SNHG8組細(xì)胞中SNHG8表達(dá)水平降低(P<0.05)，miR-411-5p表達(dá)水平升高(P<0.05)；與si-SNHG8+anti-miR-NC組比較，si-SNHG8+anti-miR-411-5p組細(xì)胞中miR-411-5p表達(dá)水平降低(P<0.05)。詳見圖1及表2、表3。

圖1 SNHG8與miR-411-5p核苷酸的連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)

表2 熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果(±s)

表3 各組SK-N-SH細(xì)胞中SNHG8和miR-411-5p的表達(dá)水平比較(±s)

2.3 SNHG8靶向負(fù)調(diào)控miR-411-5p抑制SK-N-SH細(xì)胞增殖 與對(duì)照組、si-NC組比較，si-SNHG8組SK-N-SH細(xì)胞OD值降低(P<0.05)；與si-SNHG8+anti-miR-NC組比較，si-SNHG8+anti-miR-411-5p組SK-N-SH細(xì)胞OD值升高(P<0.05)；而對(duì)照組與si-NC組，si-SNHG8組與si-SNHG8+anti-miR-NC組SK-N-SH細(xì)胞OD值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組SK-N-SH細(xì)胞OD值比較(±s)

2.4 SNHG8靶向負(fù)調(diào)控miR-411-5p誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組、si-NC組比較，si-SNHG8組SK-N-SH細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。與si-SNHG8+anti-miR-NC組比較，si-SNHG8+anti-miR-411-5p組SK-N-SH細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。而對(duì)照組與si-NC組或si-SNHG8組與si-SNHG8+anti-miR-NC組SK-N-SH細(xì)胞凋亡率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2和表5。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SK-N-SH細(xì)胞凋亡情況

表5 各組SK-N-SH細(xì)胞凋亡率比較(±s) 單位：%

2.5 SNHG8靶向負(fù)調(diào)控miR-411-5p抑制SK-N-SH細(xì)胞遷移和侵襲 與對(duì)照組、si-NC組比較，si-SNHG8組SK-N-SH細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)降低(P<0.05)；與si-SNHG8+anti-miR-NC組比較，si-SNHG8+anti-miR-411-5p組SK-N-SH細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)升高(P<0.05)；而對(duì)照組與si-NC組，si-SNHG8組與si-SNHG8+anti-miR-NC組SK-N-SH細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3及表6。

圖3 各組SK-N-SH細(xì)胞遷移和侵襲情況

表6 各組SK-N-SH細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)比較(±s) 單位：個(gè)

2.6 SNHG8靶向負(fù)調(diào)控miR-411-5p對(duì)SK-N-SH細(xì)胞中增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組、si-NC組比較，si-SNHG8組SK-N-SH細(xì)胞中Ki67、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，Cleaved-Caspases-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與si-SNHG8+anti-miR-NC組比較，si-SNHG8+anti-miR-411-5p組SK-N-SH細(xì)胞中Ki67、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，Cleaved-Caspases-3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；而對(duì)照組與si-NC組，si-SNHG8組與si-SNHG8+anti-miR-NC組SK-N-SH細(xì)胞各蛋白表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表7及圖4。

表7 各組SK-N-SH細(xì)胞中Ki67、Cleaved-Caspases-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

NB惡性程度高，早期易轉(zhuǎn)移[9]。研究NB發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并尋找有效的治療策略，是近年來研究的熱點(diǎn)問題。lncRNA參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等生命活動(dòng)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。作為一種lncRNA，SNHG8在多種腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示，SNHG8在肝癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平明顯升高，其高表達(dá)的病人預(yù)后較差，下調(diào)其表達(dá)通過負(fù)調(diào)控miR-149抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和肺轉(zhuǎn)移，可能是肝癌的潛在候選標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[10]。子宮內(nèi)膜癌組織中SNHG8表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜，過表達(dá)SNHG8抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA增殖，下調(diào)其表達(dá)則促進(jìn)Ishikawa增殖，其通過靶向負(fù)調(diào)控miR-152進(jìn)而影響肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(c-MET)的表達(dá)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖[11]。SNHG8在胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，其通過靶向miR-491/PDGFRA軸促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，可能為胃癌的治療提供了新策略[12]。SNHG8在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常胰腺組織，其高表達(dá)的病人預(yù)后較差，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞凋亡，并降低胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[13]。但目前SNHG8在NB組織中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響和作用機(jī)制還未知。

本研究首先檢測(cè)了NB組織和瘤旁組織中SNHG8的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SNHG8在NB組織中的表達(dá)明顯高于瘤旁組織，提示其也作為促癌基因參與NB的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞增殖紊亂和凋亡受阻是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)于腫瘤的治療具有積極意義[14]。Ki67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平高低可反映細(xì)胞增殖能力[15]。Caspases家族參與細(xì)胞凋亡，而Caspases-3是Caspases家族的重要成員，其活化后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)SNHG8表達(dá)可抑制SK-N-SH細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)，而促進(jìn)活化的Caspases-3蛋白表達(dá)，表明下調(diào)SNHG8表達(dá)可抑制SK-N-SH細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。基質(zhì)金屬蛋白酶是一類可降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的酶類，參與調(diào)控細(xì)胞遷移和侵襲。目前，對(duì)MMP-2和MMP-9的研究最為廣泛，其表達(dá)升高可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[17]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)SNHG8表達(dá)可降低SK-N-SH細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，抑制SK-N-SH細(xì)胞遷移和侵襲。提示SNHG8可能是NB治療的潛在分子靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步探究SNHG8影響SK-N-SH細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的分子機(jī)制，本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RT-qPCR檢測(cè)證實(shí)了SNHG8在SK-N-SH細(xì)胞中負(fù)調(diào)控miR-411-5p表達(dá)。研究顯示，miR-411-5p在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織和細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較低，上調(diào)其表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，可作為NSCLC分子治療的潛在靶標(biāo)[18]。但目前miR-411-5p在NB組織中的表達(dá)及對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響還未知。本研究結(jié)果顯示，NB組織中miR-411-5p的表達(dá)明顯低于瘤旁組織，提示miR-411-5p在NB中也發(fā)揮抑癌基因作用。本研究還顯示，下調(diào)miR-411-5p表達(dá)可減弱下調(diào)SNHG8對(duì)SK-N-SH細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，同時(shí)降低下調(diào)SNHG8對(duì)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果[19]一致，表明下調(diào)SNHG8通過靶向上調(diào)miR-411-5p表達(dá)來抑制SK-N-SH細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，NB組織中SNHG8呈高表達(dá)，而miR-411-5p呈低表達(dá)。SNHG8可能通過與miR-411-5p靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控其表達(dá)來影響NB細(xì)胞系SK-N-SH的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，SNHG8/miR-411-5p軸可能為NB的靶向分子治療提供了新靶點(diǎn)。接下來，本研究將進(jìn)一步探究miR-411-5p靶基因及下游信號(hào)通路對(duì)NB細(xì)胞系惡性生物學(xué)行為的影響，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SNHG8/miR-411-5p軸在NB中的作用。