草魚朗格漢斯細胞的組織分布及其特征基因CD207的功能分析

朱曜良，田 丁，吳志新,2，陳孝煊,2

(1.華中農業大學水產學院，武漢 430070；2.湖北省水生動物病害防控工程技術研究中心，武漢 430070)

1868年，LANGERHANS[1]在人的皮膚中發現了一種常駐的樹枝狀形態的細胞并將其命名為朗格漢斯細胞(Langerhans cells，LCs)，朗格漢斯細胞是最早發現的一類樹突狀細胞(dendritic cell，DCs)。LCs特異性分布于哺乳動物的皮膚和其它黏膜組織中，在機體抗病原感染過程中作為專職抗原提呈細胞，攝取、加工處理并遞呈抗原給T淋巴細胞，誘導相應的免疫反應[2]。LCs的直接前體細胞是一種高表達髓系分化抗原Gr-1分子的單核細胞，且集落刺激因子1受體(colony-stimulating factor-1 receptor，CSF-1R)、生長轉化因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等一系列可溶性細胞因子在LCs的遷移、發育過程中發揮關鍵作用[3-5]。LCs的表面標志物主要由主要組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ)，CD1a，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和Langerin/CD207組成[6]。LCs對抗原的攝取加工需要表達Langerin/CD207，一種參與伯貝克顆粒(Birbeck granule)形成的C型凝集素[7]。CD207是Ⅱ型跨膜糖蛋白，為LCs特征性膜表面分子標記，因此CD207的表達也被廣泛應用于朗格漢斯細胞的鑒定[8]。

關于哺乳動物LCs的研究已較為深入，而在硬骨魚類中，鮮有關于LCs的研究報道。近年來，由于缺乏魚類特異性CD207抗體，人源CD207多克隆抗體被普遍應用于硬骨魚類LCs的鑒定。LOVY等[9]在孢子蟲感染的大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)的鰓中發現了LCs。隨后，在安大略鱒(Salmosalar)、虹鱒(O.mykiss)、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、美洲紅點鮭(Salvelinusfontinalis)以及多種輻鰭亞綱(Actinopterygii)魚類的頭腎及脾臟中也發現了LCs[10-13]。最近，WANG等[14-15]利用透射電鏡和人源CD207多克隆抗體在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)脾臟、頭腎和草魚脾臟中分別觀察到了LCs及其特征性標志物-伯貝克顆粒(Birbeckgranule)，證明了黃顙魚和草魚體內朗格漢斯細胞的存在。

本實驗室在前期的工作中制備了草魚CD207多克隆抗體，可以特異性識別組織和細胞水平的內源性CD207蛋白[16]。目前草魚體內LCs的分布及其特征性基因CD207的功能尚未闡明，本研究利用草魚CD207多克隆抗體對LCs在草魚相關免疫組織的分布情況進行鑒定，結合qPCR技術對CD207在感染中的表達情況進行分析，從而探討LCs在草魚抗病原免疫過程中的功能，為后續深入研究草魚LCs及其它樹突狀細胞亞群的生物學功能提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用魚

實驗草魚(Ctenopharyngodonidella)于2021年9月購自湖北省黃岡市團風縣百容水產良種有限公司。選取每尾體質量(200～300)g的健康草魚，在循環水系統中暫養3周(華中農業大學水產學院水產養殖教學實驗中心)，水溫(26±2)℃。期間按體質量的4%投喂商業飼料(湖北海大集團)，飼料營養成分主要包括32%粗蛋白，13%粗灰分，1.6%賴氨酸，4%粗脂肪。每日更換1/3的水并清潔殘余的飼料殘渣。

1.1.2 實驗試劑

LPS(E.coli055:B5，L6529)、PolyI:C(P9582)、Percoll分離液購自Sigma公司，HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor 555標記山羊抗兔IgG(H+L)購自武漢愛博泰克公司，DAPI染色液購自上海碧云天生物技術有限公司，FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

利用大腸桿菌表達系統表達草魚CD207的胞外區片段作為抗原免疫新西蘭大白兔(Oryctolaguscuniculus)，制備草魚CD207多克隆抗體。酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)其效價為1∶128 000，可識別組織和細胞水平分別對應的內源性蛋白，特異性較高[16]。

AIM液：含有47.5 mL L-15培養基，2.5 mL雙抗，2.5 μg/mL兩性霉素B和25 μg/mL慶大霉素，置于4 ℃備用。

細胞原代培養基：含有44.5 mL L-15培養基，0.5 mL雙抗，5 mL胎牛血清(FBS)，2.5 μg/mL兩性霉素B和25 μg/mL慶大霉素，置于4 ℃備用。

1.1.3 引物列表

從NCBI GenBank數據庫中獲取CD207(GenBank:GBKA01017435.1)、β-actin(GenBank:M25013)基因的核苷酸序列，利用Primer 5.0軟件分別設計CD207、β-actin的特異性引物。引物序列見表1，引物由武漢擎科生物技術有限公司合成。

表1 引物堿基序列Tab.1 Nucleotide sequences of primers

1.2 免疫熒光

(1)取材固定：分別取草魚頭腎、鰓、皮膚、腸道的新鮮組織塊，避免牽拉、挫傷與擠壓，組織體積不超過1 mm×1 mm×1 mm，迅速投入4%多聚甲醛固定液固定24 h。將組織從固定液中取出，在通風櫥中用手術刀修平整，放入脫水盒內。

(2)脫水、透明、浸蠟：采用從低濃度到高濃度逐級升高的梯度乙醇對組織塊進行脫水，然后浸入二甲苯中將組織塊透明，脫水透明后的組織塊在熔化的石蠟包埋劑中浸蠟。

(3)包埋、切片、脫蠟至水：將完成浸蠟的組織塊放入包埋框內包埋，于-20 ℃凍臺冷卻，將預冷的蠟塊固定在石蠟切片機上切4 μm厚度切片，將切片在攤片機的溫水(45 ℃)上攤平，放置65 ℃烤片機上烤1 h，再放置烘箱內烘烤2 h，之后經二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水，最后蒸餾水洗。

(4)抗原修復、畫圈、血清封閉：切片置于盛滿乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復緩沖液(pH 8.0)的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，自然冷卻后將玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈，在圈內滴加牛血清白蛋白(BSA)孵育30 min。

(5)加兔抗草魚CD207一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加1∶200(體積比)稀釋的一抗，切片平放于濕盒內4 ℃孵育過夜。

(6)加Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內滴加1∶200(體積比)稀釋的二抗，避光室溫孵育50 min。

(7)DAPI復染細胞核：切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。

(8)自發熒光淬滅：切片稍甩干后，在圈內加入自發熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。

(9)封片：玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

(10)鏡檢拍照：切片置于掃描儀下采集圖像或熒光顯微鏡下拍照。(DAPI紫外激發波長330～380 nm，發射波長420 nm，發藍光；Alexa Fluor 555激發波長510～560，發射波長590 nm，發紅光；DAPI染細胞核在紫外的激發下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光)。

1.3 草魚頭腎白細胞的分離和處理

在無菌條件下取出草魚頭腎，AIM液中浸泡，用無菌注射器橡膠塞輕輕按壓通過200目(70 μm)細胞篩。向15 mL離心管中依次加入51% Percoll分離液、34% Percoll分離液、過細胞篩的單細胞懸液，800g室溫離心20 min后，吸取界面層之間的“白膜層”細胞，無菌PBS洗滌兩次，加入細胞原代培養基重懸并調整密度為1×106cells/mL備用。

參考WANG等[17]和SU等[18]的方法，實驗組白細胞分別加入終濃度為100 μg/mL的LPS和終濃度為50 μg/mL的PolyI:C，對照組白細胞加入等量無菌PBS溶液，處理12 h，每組設置三個重復。

1.4 草魚CD207基因的表達分析

采用相對定量的方法對草魚CD207基因經不同抗原處理后的表達量進行測定。分別離心收集步驟1.3處理所得細胞，草魚頭腎白細胞總RNA的提取和反轉錄，以及熒光定量PCR(qPCR)分別參照對應試劑盒說明書進行。qPCR采用20 μL反應體系：SYBR qPCR Master Mix(2×)10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。以2-ΔΔCt方法計算各組相對表達量，β-actin為內參基因，并進行顯著性差異分析?！?”表示與對照組差異顯著(P<0.05)。

1.5 草魚CD207蛋白的表達分析

將步驟1.3處理后所得細胞樣品分別與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)在金屬浴中100 ℃處理10 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白質印跡檢測，采用半干法，將凝膠上的蛋白樣品轉移至PVDF膜上，首先加入5% 脫脂奶粉封閉2 h，然后用相應抗體(CD207多抗和β-actin內參抗體)與PVDF膜室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜15 min，重復4次；最后用HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗室溫孵育50 min；TBST緩沖液洗膜10 min，重復3次后將ECL化學發光液覆蓋在膜上，置于化學發光成像儀中成像。ImageJ軟件(National Institutes of Health)進行灰度分析，并進行顯著性差異分析。“*”表示與對照組差異顯著(P<0.05)。

1.6 數據處理

所有數據采用平均值±標準誤差表示，P<0.05時為統計學差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖，Adobe Illustrator 2020修圖。采用SPSS 24.0軟件對實驗數據進行統計學分析。

2 結果

2.1 朗格漢斯細胞在草魚相關免疫組織分布情況

通過免疫熒光技術，在草魚的頭腎(圖1a)，鰓的鰓小片(圖1c)，皮膚的表皮及真皮(圖1e)和腸道固有層(圖1h)中均發現CD207陽性細胞(紅色)的存在。免疫熒光顯示LCs具有腎形或橢圓形的細胞核，頭腎中LCs的胞體呈不規則形狀突起，而鰓、皮膚、腸道中LCs的胞體則呈橢圓形。此外，LCs的細胞膜和細胞質中均有CD207蛋白的分布。

2.2 LPS、PolyI:C分別處理對CD207基因表達的影響

qPCR的結果顯示，在處理12 h后，LPS(圖2a)、PolyI:C(圖2b)均能夠誘導草魚CD207基因相對表達量發生顯著上調。

2.3 LPS、PolyI:C分別處理對CD207蛋白表達的影響

蛋白質印跡的結果顯示，LPS(圖3a)、PolyI:C(圖3b)均能夠誘導CD207蛋白表達量增多。ImageJ進行灰度分析，顯示CD207蛋白相對表達量均發生顯著上調，β-actin為內參蛋白。

圖1 草魚頭腎、鰓、皮膚和腸道中的CD207陽性細胞Fig.1 CD207 positive cells in head kidney，gill，skin and intestine of C.idellaa～b：頭腎；c～d：鰓；e～g：皮膚；h～i：腸道；I：鰓小片；Ⅱ：表皮；Ⅲ：真皮；Ⅳ：固有層；Ⅴ：腸腔。圖中箭頭所示為CD207陽性細胞。

圖2 實時熒光定量PCR檢測LPS、PolyI:C對草魚CD207基因相對表達量的影響Fig.2 Effects of LPS and PolyI:C on the relative mRNA expression of CD207 gene in C.idella detected by qPCR“*”為差異顯著(P<0.05)。下同。

圖3 LPS、PolyI:C對草魚CD207蛋白相對表達量的影響Fig.3 Effects of LPS and PolyI:C on relative expression of CD207 protein in C.idella

3 討論

3.1 草魚朗格漢斯細胞在相關免疫組織的分布情況

樹突狀細胞在連接微生物病原體入侵機體所產生的先天性免疫和適應性免疫反應中起關鍵性橋梁作用，且樹突狀細胞各個亞群的形態、表面表型分子、組織分布和生物學功能也不盡相同[19]。LCs作為主要分布于黏膜免疫組織的樹突狀細胞亞群，已成為病原體通過黏膜入侵機體和維持機體穩態的研究熱點[20]。頭腎作為硬骨魚類所獨有的重要免疫器官，其中分布有大量的白細胞(包括單核細胞)[21]，而LCs也由單核細胞分化而來，免疫熒光顯示LCs在草魚的頭腎中分布，這提示頭腎可能是LCs的發生場所之一。

皮膚、鰓和腸道組成了硬骨魚類黏膜相關淋巴組織(mucosal associated lymph tissue，MALT)。這些組織富含黏膜層，與外部水環境直接接觸，構成了魚體免疫系統的第一道免疫防線[22]。魚類皮膚中包含大量的黏液細胞和各類免疫細胞，與多種免疫相關因子形成了抵御病原微生物感染的“額外器官”[23]。免疫熒光定位LCs在存在于草魚皮膚的表皮和真皮中，表明LCs是魚類皮膚免疫系統的組成部分，也為后續深入解析魚類皮膚免疫的生態網絡結構提供基礎資料。和皮膚黏膜類似，魚類的鰓也是與水環境相互作用密切的黏膜器官。鰓中分布的各類免疫細胞，可以在病原體入侵機體時參與抗原攝入和激活免疫應答反應[24]。免疫熒光顯示LCs分布于草魚鰓的鰓小片中，提示草魚患鰓部疾病時，LCs能夠識別呈遞抗原，參與草魚機體的免疫監視。硬骨魚類缺乏腸道相關淋巴組織(gut associated lymphoid tissues，GALT)，如派爾集合淋巴結(Peyer patch)等，但是腸道固有層和上皮中含有大量的免疫細胞，包括淋巴細胞、顆粒細胞和肥大細胞等[25]。免疫熒光顯示LCs分布于草魚腸道固有層，這說明當顆粒狀或大分子抗原入侵草魚腸道時，來自腸腔的抗原經由腸上皮層包裹處理，后傳遞到腸道固有層，通過LCs的識別、加工和呈遞給淋巴細胞，產生相應的免疫應答。

開展魚類黏膜免疫中的抗原攝取、遞呈和后續免疫反應的研究，完善黏膜免疫的應答機制，可以改善漁用疫苗的實驗效果[26]。本實驗鑒定了LCs在草魚相關免疫組織的分布情況，豐富了草魚樹突狀細胞亞群的研究內容，同時為黏膜疫苗的研發以及水產疫苗浸泡免疫的研究和推廣等提供基礎理論資料。

3.2 草魚朗格漢斯細胞特征性基因CD207的功能分析

LCs在系統早期的細菌感染起到關鍵作用[27]，CD207能識別病原體表面碳水化合物結構(如甘露糖、巖藻糖和N-乙酰葡萄糖胺)，將抗原肽與MHC分子結合形成抗原肽-MHC復合體，從而呈遞抗原參與適應性免疫應答[28]。VANDER等[29]發現人LCs能通過CD207攝取麻疹病毒(measles virus，MV)抗原并呈遞給特異性CD4+T細胞以維持人體穩態。VANDEN等[30]也證明CD207促進人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)轉移并刺激LCs及部分樹突狀細胞亞群成熟，從而誘導CD8+T細胞的增殖活化。這表明LCs可以通過表達其特征性分子標記物CD207，在攝取、加工處理、呈遞抗原進而引發特異性T淋巴細胞的產生，抗細菌、病毒感染方面都有不可忽視的作用。

原代培養細胞仍然保留部分甚至全部同在體細胞一樣的生理功能特性，細胞仍然保持高度的分化性以及功能性，因此原代培養細胞被認為可以取代動物活體開展部分生命科學研究[31]。而且免疫刺激硬骨魚的細胞模型后，各種免疫基因表達水平的快速反應也已被多方證實[32]。在培養魚類原代細胞過程中，使用L-15原代細胞培養基(含10% FBS)同時維持培養基pH為7.0～7.4，并放置于28 ℃細胞培養箱，從而保持細胞在離體條件下的生理功能完整性，也避免了因細胞生長代謝受到抑制而引起的胞內mRNA的降解[33]。

免疫熒光顯示LCs在草魚頭腎中分布，為排除正常體內自體調節和應激反應可能產生的整體因素影響，本實驗對草魚頭腎白細胞進行分離培養，為天然免疫基因CD207的功能分析提供了可行工具。利用LPS、PolyI：C分別處理草魚頭腎白細胞，結果顯示CD207的mRNA和蛋白的相對表達量均有顯著性上調(P<0.05)。這表明在細菌或病毒入侵機體時，草魚LCs可以通過上調CD207的表達，識別并呈遞外源性抗原，參與到草魚的適應性免疫調節反應中，提示草魚LCs的特征性基因CD207表現出與哺乳動物CD207分子同系物相似的免疫功能。對草魚CD207分子的研究，將有助于我們更好地了解LCs在硬骨魚類免疫系統中的作用，為養殖過程中細菌性、病毒性疾病的防控提供理論基礎。

4 結論

綜上，本實驗利用免疫熒光鑒定出LCs在草魚的頭腎，皮膚的表皮和真皮，腸道固有層和鰓的鰓小片中分布。運用蛋白質印跡法和qPCR對LPS、PolyI:C處理后草魚頭腎白細胞中的CD207表達情況進行分析，發現CD207的mRNA和蛋白的相對表達量均有顯著性上調。結果表明，LCs分布于草魚相關免疫組織中，特別是黏膜相關淋巴組織，可以通過表達CD207參與到草魚抗細菌、病毒等外源性抗原的免疫反應中去。