PTPN22基因多態性與重癥肌無力的相關性

蘇 源， 王 琦， 張賢軍， 岳耀先

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是典型的累及神經肌肉接頭的自身免疫性疾病。在細胞免疫和補體的參與下，自身抗體破壞乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)等突觸后膜結構，引起神經肌肉信號傳導障礙，出現肌肉無力的癥狀[1]。蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(protein tyrosine phosphatase，non-receptor type 22，PTPN22)基因編碼淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶(lymphoid protein tyrosine phosphatase，Lyp)，該分子通過促進Lck和zap-70脫磷酸來抑制T細胞受體的信號傳導，并與負調控因子Csk結合，協同抑制T細胞胞內的激酶和磷酸酶之間的信號傳遞，發揮關鍵的免疫穩態調控作用[2，3]。多篇文獻報道了PTPN22基因多態性與MG的易感性相關[4～9]。本研究比較MG患者和健康人群的PTPN22基因rs2488457和rs3811021位點的多態性，探索其與MG易感性、嚴重程度和轉型的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究納入480例MG患者作為病例組，相同地區的487例健康查體人員作為健康對照組。入組及排除標準、知情同意及倫理審批在前期研究中已詳述[10]，依照性別、發病年齡[11]、首發受累范圍、AChR抗體、胸腺情況等臨床特征將MG組分為亞組，在病程2年以上且資料充分的患者中，根據病程2年內最重時Oosterhuis評分[12]將患者分成嚴重程度亞組，根據眼肌型起病者2年間是否轉化成全身型分成轉型亞組。

1.2 研究方法

1.2.1 標本收集及儲存 采集MG患者和健康查體人員外周靜脈血約5 ml，2500 r/min離心10 min，取血細胞分裝于1.5 ml離心管中，采用Wizard?基因組DNA 純化試劑盒(Promega，USA)提取DNA，-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 選點策略及基因分型 復習文獻，既往多篇文章研究了PTPN基因rs2476601、rs2488457、rs33996649和rs3811021位點[13～15]與MG等自身免疫疾病的相關性。由于在中國人群中rs2476601和rs33996649位點無多態性，故選取rs2488457和rs3811021位點進行研究。通過人類基因組單體型圖(Hapmap)中北京地區漢族人群(CHB)基因數據庫查閱，rs2488457和rs3811021位點最小等位基因頻率均大于0.05，分別位于PTPN22基因啟動子區域和3’UTR區。采用上海天昊遺傳分析中心的iMLDRTM多重基因分型試劑盒對rs2488457和rs3811021位點進行基因分型[16]。

1.3 統計方法 應用SPSS18.0軟件進行統計學分析，P<0.05認為差異有統計學意義。采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗的統計學方法，比較MG整組與健康對照組、MG各亞組(發病年齡、胸腺情況、AChR抗體、首發受累范圍、病程2年內最重時Oosterhuis評分、轉型情況)與健康對照組以及MG亞組間等位基因頻率的差異，并比較其在加性和共顯性遺傳模型下基因型頻率的差異。使用SNPstats在線軟件將對照組數據進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。當MG亞組與對照組或亞組間等位基因頻率存在顯著差異(P<0.05)時，使用Logistic回歸分別在共顯性與加性遺傳模型下進行校正。對易感性分析，還采用我們提出的一個新的復合分類方法[17]劃分亞組，該方法采用臨床特征的特定組合作為分類依據，消除了單一臨床特征作為分類依據時其他臨床特征的混雜影響。

2 結 果

2.1 MG組和健康對照組一般資料 將本研究納入的480例MG患者(男189例，女291例)和487例健康對照(男249例，女238例)進行統計學分析。MG患者發病年齡為1～86歲(中位數40，四分位數間距32)，對照組年齡14～78歲(中位數45歲，四分位數間距24)。MG組患者總病程8～220個月(中位數43，四分位數間距61)，每年平均隨訪6.5次。

rs2488457分型成功率為99.79%；rs3811021分型成功率為99.59%。對照組中兩個SNP的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)。rs2488457及rs3811021位點對照組MAF分別為0.34及0.19，與Hapmap中國漢族人群MAF報道接近(分別為0.305及0.159)。

2.2 MG整組和健康對照組比較 MG整組與對照組相比，rs2488457及rs3811021位點的等位基因頻率和共顯性及加性遺傳模型下基因型頻率均無顯著性差異(P>0.05，見表1)。

表1 PTPN22基因多態性與MG整組相關性分析

2.3 MG各亞組間及各亞組與健康對照組比較

2.3.1 易感性分析 將MG組根據關鍵臨床特征分為性別、發病年齡(<15、15～50歲和>50歲)、胸腺情況(伴/不伴胸腺瘤)、AChR抗體(陽性/陰性)和首發受累范圍(眼肌型/全身型亞組)。各亞組與對照組進行比較，以及各亞組間比較，PTPN22基因rs2488457及rs3811021位點的等位基因頻率和基因型頻率(共顯性及加性遺傳模型下)均無顯著性差異(P>0.05，見表2)。因亞組間無差異，故未進行Logistic回歸分析。

既往研究發現MG各關鍵臨床特征之間存在相互混雜[18]，因此單一分組方法無法準確反映MG的表型。我們提出的新的復合分類方法根據MG的關鍵臨床特征組合形成有生物學和臨床意義的亞組，使每個信息完整的患者均被且只被分到一個亞組。

表2 PTPN22基因多態性與MG亞組相關性分析[例數(%)]

對照組胸腺瘤伴有不伴首發受累范圍眼肌型全身型Oosterhuis評分0～2分3～5分2年內轉型轉型未轉型總例數rs2488457GGGCCCMAF(C)rs3811021AAGAGGMAF(G)487487△216 (44.4)213 (43.7)58 (11.9)0.34▲486316 (65)156 (32.1)14 (2.9)0.1910710746 (43)46 (43)15 (14)0.3610669 (65.1)34 (32.1)3 (2.8)0.19367365154 (42.2)175 (48)36 (9.9)0.34365245 (67.1)113 (31)7 (1.9)0.17342340145 (42.6)159 (46.8)36 (10.6)0.34340229 (67.3)104 (30.6)7 (2.1)0.1713513556 (41.5)63 (46.7)16 (11.8)0.3513487 (64.9)44 (32.8)3 (2.2)0.1921621583 (38.6)109 (50.7)23 (10.7)0.36215145 (67.4)65 (30.2)5 (2.3)0.1715415365 (42.5)69 (45.1)19 (12.4)0.3515299 (65.1)51 (33.5)2 (1.3)0.1813913857 (41.3)68 (49.3)13 (9.4)0.3413889 (64.5)48 (34.8)1 (0.7)0.1815115064 (42.7)72 (48)14 (9.3)0.33150108 (72)38 (25.3)4 (2.7)0.15

各亞組與對照組比較及各亞組間比較，PTPN22基因 rs2488457及rs3811021位點的等位基因頻率和基因型頻率(共顯性及加性遺傳模型下)均無顯著性差異(P>0.05，見表3)。

表3 PTPN22基因多態性與MG復合分類亞組相關性分析[例數(%)]

2.3.2 嚴重程度分析 嚴重程度亞組與對照組及嚴重程度亞組之間比較，PTPN22基因rs2488457及rs3811021位點的等位基因頻率和基因型頻率(共顯性及加性遺傳模型下)均無顯著性差異(P>0.05，見表2)。

2.3.3 轉型分析 轉型亞組與對照組、轉型亞組之間比較，PTPN22基因rs2488457及rs3811021位點的等位基因頻率和基因型頻率(共顯性及加性遺傳模型下)均無顯著性差異(P>0.05，見表2)。

3 討 論

PTPN通過其編碼的蛋白，負性調控T細胞的抗原識別和傳遞活化信號，從而發揮關鍵的免疫穩態調控作用[19]。既往已有多篇文獻報道PTPN基因多態性與MG的相關性[4～9]。本研究納入480例MG患者和487例健康對照者，統計分析未發現rs2488457和rs3811021位點等位基因和基因型頻率在MG整組及各亞組間存在顯著性差異。由于單一臨床特征作為分組依據時會因臨床特征間的相互作用而導致混雜，所以本研究預設了兩種驗證方式。一是對某一臨床特征陽性亞組采用Logistic回歸對其他臨床特征進行校正，但由于未發現亞組間及亞組與對照組的差異，故無法進行此校正。二是采用新的復合分類方法，該分類消除了臨床特征間的相互作用，符合目前MG臨床分類原則[17]。采用新分類亞組也未發現rs2488457和rs3811021位點等位基因和基因型頻率在各亞組間存在顯著性差異。故認為rs2488457和rs3811021位點與MG的易感性無關。

嚴重程度和轉型是MG的重要特征，我們以長期隨訪的完善資料并以嚴謹的定義對有這些資料的患者進行了分類，也未發現rs2488457和rs3811021位點與MG的嚴重程度和轉型相關。

國外僅1篇文章[9]報道rs2488457位點基因多態性與MG的相關性，Provenzano等納入356例意大利MG患者和439例健康對照，選取rs2488457位點，比較MG組及AChR抗體、MuSK抗體、胸腺瘤、性別、發病年齡各亞組與對照組等位基因及基因型頻率，未見顯著性差異，這與本研究的結果是一致的。然而，rs2488457的最小等位基因頻率及基因型頻率與低滴度AChR抗體亞組相關(OR=2.10，P=0.019)，而與高滴度AChR抗體亞組無關(OR=0.94，P=0.85)。如果該位點與AChR抗體陽性相關，按照共顯性或加性模型該位點應該與抗體高滴度組也相關，甚至OR值更高，因此該研究中與低滴度組的相關可能由抽樣誤差所致。另外該研究中，rs2488457位點健康對照組MAF為0.187，與本研究健康對照組MAF(0.34)存在顯著性差異，不同人群的遺傳背景也可能影響研究結果。

國內尚無rs2488457位點基因多態性與MG的相關性報道，但多篇文獻報道rs2488457位點基因多態性與中國漢族人群其它自身免疫疾病(如潰瘍性結腸炎[20]、類風濕性關節炎[21，22]、強直性脊柱炎[23]、小柳原田綜合征[24])有相關性。上述研究中大多數研究對照組的等位基因頻率與本研究以及Hapmap數據庫中中國人的頻率相近，只有部分研究與本文差異較大(見表4)。故考慮本研究未發現rs2488457位點與MG的易感性、嚴重程度和轉型的相關性并非本研究抽樣誤差所致，的確該位點多態性與MG的易感性、嚴重程度和轉型無關。

表4 中國漢族人群自身免疫病研究中，rs2488457和rs3811021位點對照組MAF資料

國內外尚無rs3811021位點基因多態性與MG的相關性報道，在中國漢族人群中，僅1篇文獻報道rs3811021位點基因多態性與中國漢族人群類風濕關節炎[25]有相關性，其他自身免疫病如Graves病[26]、特發性血小板減少性紫癜[27]及白癜風[28]均未發現與rs3811021位點基因多態性有相關性。本研究中rs3811021位點MAF與上述研究及Hapmap報道的MAF接近(見表4)，故考慮本研究rs3811021位點與MG的易感性、嚴重程度和轉型的無相關性并非抽樣誤差所致，的確rs3811021位點多態性與MG的易感性、嚴重程度和轉型無關。

綜上所述，本研究未發現PTPN22基因rs2488457及rs3811021位點基因多態性與中國人群重癥肌無力易感性、嚴重程度和轉型有關。