NLRP3炎癥小體：缺血性腦卒中的潛在治療靶點

張 朋， 韓榮榮綜述， 張愛梅審校

缺血性腦卒中發(fā)生后的病理生理過程非常復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)、酸中毒、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、血腦屏障破壞、膠質(zhì)細胞活化和補體激活等。上述病理過程相互作用，形成正反饋調(diào)節(jié)，進一步加重神經(jīng)細胞死亡和腦組織損傷[1]。目前，臨床上公認的治療急性缺血性腦卒中的有效手段包括靜脈溶栓和血管內(nèi)取栓[2]。然而，除了嚴格的時間窗限制外，靜脈溶栓和血管內(nèi)取栓均面臨一個重要問題，那就是血管再通后由炎癥反應(yīng)引起的缺血再灌注損傷。因此，如何盡可能減輕缺血性腦卒中后的神經(jīng)炎癥是臨床上亟待解決的問題。

近年來，人們對信號通路中的炎癥小體的關(guān)注與日俱增，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是最早發(fā)現(xiàn)的炎癥小體之一，它是檢測腦卒中后細胞損傷以及介導(dǎo)腦卒中后神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)[3，4]。針對NLRP3炎癥小體及其上下游通路的調(diào)控可能為缺血性腦卒中提供新的治療策略。因此，本文對NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu)、激活、組裝和調(diào)控做一綜述并著重介紹NLRP3炎癥小體在缺血性腦卒中治療中的潛在靶點和國內(nèi)外最新研究進展。

1 NLRP3炎癥小體

1.1 NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu) NLRP3炎癥小體主要表達于巨噬細胞、神經(jīng)細胞、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞等這些細胞的胞漿中，由以下三種成分組成：NLRP3受體蛋白、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白[apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體(pro-caspase-1)，這三種蛋白相互作用，共同調(diào)節(jié)炎癥小體的功能[5]。NLRP3受體蛋白屬于NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)家族的蛋白質(zhì)成員，由人類的22個基因家族編碼，是最典型的炎癥小體傳感器分子。NLRP3受體蛋白由三個結(jié)構(gòu)域組成，包括一個位于中央的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding and oligomerization domain，NACHT)，一個氨基末端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)和一個羧基末端的亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat，LRR)，羧基末端的LRR結(jié)構(gòu)域主要參與識別刺激，中央的NACHT結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)自身寡聚，氨基末端的PYD主要與下游同型蛋白結(jié)合。ASC由兩個相互作用結(jié)構(gòu)域組成，包括氨基末端的PYD和羧基末端CARD。Pro-caspase-1包括CARD(與ASC尾端的CARD結(jié)合)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(caspase)。在外界刺激因子的作用下，NLRP3受體蛋白、pro-caspase-1和ASC組裝成NLRP3炎癥小體，進而誘發(fā)一應(yīng)系列炎癥反應(yīng)[5～8]。

1.2 NLRP3炎癥小體的激活和組裝 NLRP3炎癥小體的激活由以下兩個階段組成：第一階段為啟動階段，由病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式的識別所誘導(dǎo)[9]。通過激活核因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路，促進NLRP3、白介素1β前體(pro-Interleukin-1β，pro-IL-1β)和白介素18前體(pro-Interleukin-18，pro-IL-18)等蛋白的表達[10]。第二個階段為激活階段，是由組織損傷、感染或代謝失衡等一系列刺激誘導(dǎo)。在這一階段，K+外流、Na+內(nèi)流、溶酶體損傷、活性氧的生成以及線粒體功能障礙等刺激均可促進NLRP3炎癥小體的組裝[11]。

NLRP3炎癥小體的組裝是通過NLRP3受體蛋白的PYD和ASC的PYD相互作用而啟動的[12]。在感知到危險信號后，NLRP3單體發(fā)生寡聚并通過與ASC的PYD相互作用而募集ASC，進而形成一個大的斑點結(jié)構(gòu)[7]。在形成斑點結(jié)構(gòu)后，pro-caspase-1通過CARD-CARD相互作用被募集，并通過CARD-caspase接頭區(qū)域的切割而被激活[13]。至此，級聯(lián)激活的NLRP3/ASC/caspase-1多蛋白復(fù)合體，即NLRP3炎癥小體組裝完畢。具有生物活性的caspase-1將促炎細胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18分別切割為成熟的IL-1β和IL-18，隨后這些成熟的細胞因子被分泌到細胞外發(fā)揮促炎作用，同時，caspase-1可以解離消皮素D(Gasdermin D，GSDMD)，釋放其活性N-末端片段，GSDMD的N-末端片段與細胞膜中的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇磷酸結(jié)合，形成一個1020 nm的孔隙，并觸發(fā)一種裂解形式的細胞死亡，稱為細胞焦亡，進而促進成熟的IL-1β和IL-18分泌到細胞外，最終誘發(fā)更廣泛、更強烈的炎癥反應(yīng)[14](見圖1)。

2 基于NLRP3炎癥小體治療缺血性腦卒中的相關(guān)藥物及其機制

越來越多的證據(jù)表明NLRP3炎癥小體介導(dǎo)缺血性腦卒中后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，這里我們總結(jié)了幾種針對NLRP3炎癥小體治療缺血性腦卒中的藥物及其相關(guān)調(diào)控機制(見圖1、表1)。

表1 藥物干預(yù)NLRP3炎癥小體治療缺血性腦卒中的國內(nèi)外研究進展

注：NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；ASC：凋亡相關(guān)斑點樣蛋白；pro-caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前體；PYD：熱蛋白結(jié)構(gòu)域；NACHT：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域；LRR：亮氨酸重復(fù)序列；CARD：凋亡相關(guān)斑點樣蛋白；caspase：天冬氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域；NF-κB：核因子-κB；TXNIP：硫氧還蛋白相互作用蛋白；AMPK/GSK-3β：腺苷酸活化蛋白激酶/糖原合成酶激酶3β；GSDMD：消皮素D；procyanidins：原花青素；PAEs：純化的花青素提取物；immunoproteasome：免疫蛋白酶體；APNp：脂聯(lián)素肽；Hispidulin：高車前素；Evs：細胞外囊泡；Z-GS：香膠甾酮；ROS：活性氧；IL-1β：白細胞介素-1β；IL-18：白細胞介素-18

2.1 NLRP3炎癥小體小分子抑制劑 MCC950是NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑，Saifudeen等人證明MCC950對小鼠短暫性大腦中動脈閉塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型有神經(jīng)保護作用，與對照組相比，使用MCC950處理的實驗組小鼠可顯著降低腦卒中后腦梗死以及腦水腫體積，并且降低了半暗帶區(qū)NLRP3炎癥小體裂解產(chǎn)物caspase-1以及IL-1β的表達[15]。另外一項動物實驗表明，使用小鼠tMCAO模型模擬腦缺血再灌注損傷，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體主要在缺血側(cè)神經(jīng)元中表達并且誘導(dǎo)驅(qū)動了急性缺血性腦卒中后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，NLRP3炎癥小體的上調(diào)發(fā)生在缺血性腦卒中的早期，對應(yīng)于人類缺血性腦卒中的超急性期和急性期，使用MCC950阻斷NLRP3炎癥小體可以減輕炎癥和穩(wěn)定血腦屏障，進而減輕缺血再灌注損傷[16]。以往的研究認為，水通道蛋白-4調(diào)節(jié)腦組織中水分子的轉(zhuǎn)運，內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)腦水腫。一項動物實驗表明，在小鼠tMCAO模型中，實驗組小鼠腹腔注射MCC950，檢測腦組織中NLRP3、IL-1β、IL-18、GSDMD、水通道蛋白-4、內(nèi)皮素-1的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體促進小鼠腦組織水腫以及血腦屏障破壞，腹腔注射MCC950可以降低水通道蛋白-4和內(nèi)皮素-1的水平以及調(diào)節(jié)水通道蛋白-4在梗死區(qū)的表達和分布。因此，NLRP3炎癥小體可能也是治療腦缺血再灌注后腦組織水腫的重要靶點[17]。綜上，MCC950作為NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑可能是一種很有前途的治療藥物，可以在腦血管閉塞以及再通后的缺血再灌注期間抑制炎癥反應(yīng)，但MCC950的治療效果和方案有待進一步研究，以確定其是否有希望成為臨床試驗的候選者，并且目前還沒有臨床批準的針對NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑，然而，有研究支持通過Bruton酪氨酸激酶抑制劑伊布替尼(PCI-32765)靶向抑制NLRP3炎癥小體的觀點，這或許能為缺血性腦卒中相關(guān)炎癥提供新的治療手段[18]。

2.2 NLRP3炎癥小體與自噬誘導(dǎo)劑 自噬是溶酶體參與的一種高度保守的分解代謝途徑[19]，既往的研究表明，自噬活性可以通過清除缺血腦組織產(chǎn)生的線粒體DNA和線粒體活性氧來抑制NLRP3炎癥小體的激活以及IL-1β的表達，進而減輕腦缺血再灌注損傷[20]。因此，自噬誘導(dǎo)治療的有效性受到許多學(xué)者的關(guān)注，近年來，一些研究探討了自噬誘導(dǎo)劑對NLRP3炎癥小體調(diào)控的作用以及與缺血性腦卒中的關(guān)系。

最近的一項體外實驗發(fā)現(xiàn)，采用BV2型小膠質(zhì)細胞氧-糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型模擬缺血性腦損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)京尼平苷可降低小膠質(zhì)細胞OGD/R模型中NLRP3、ASC、caspase-1以及IL-1β的水平，而自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達增加，表明京尼平苷能顯著減輕OGD/R后BV-2型小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其具體機制可能是通過促進自噬活性進而抑制NLRP3炎性小體的表達來實現(xiàn)神經(jīng)保護作用的[21]。另有研究表明，使用小膠質(zhì)細胞特異性過表達過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α)的轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)tMCAO模型，觀察過表達PGC-1α小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和基因表達譜以及NLRP3炎癥小體的激活和下游炎性因子的產(chǎn)生情況，采用染色質(zhì)免疫沉淀-測序技術(shù)檢測小膠質(zhì)細胞中PGC-1α的結(jié)合位點，通過對UNC-51樣激酶1(unc-51 like kinase 1，ULK1)的藥物抑制和基因組敲除來評估ULK1在缺血性腦卒中后介導(dǎo)的線粒體自噬作用，結(jié)果表明PGC-1α通過ULK1促進自噬以及線粒體自噬活性，反過來，這個過程又進一步抑制了由NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[22]。有研究證明，糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的重要危險因素[23]，在許多疾病中均可抑制自噬活性。采用大鼠MCAO/R模型模擬大鼠腦缺血再灌注損傷，使用GSK-3β的化學(xué)抑制劑SB216763或者GSK-3βsiRNA抑制GSK-3β在體內(nèi)的激活和表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制GSK-3β可通過增強自噬活性而抑制NLRP3炎癥小體的表達[24]。Luo等人證明，在大鼠tMCAO模型中，6-姜辣素通過TRPV1/FAF1復(fù)合體的解離誘發(fā)自噬進而抑制NLRP3炎癥小體的活化來減輕缺血再灌注損傷[25]。以上表明腦缺血后自噬活性被顯著激活且與神經(jīng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，自噬是負性調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的重要因素。缺血性腦卒中后通過誘導(dǎo)自噬激活，下調(diào)NLRP3/ASC/caspase-1級聯(lián)反應(yīng)信號通路，從而抑制NLRP3炎癥小體，進而減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)。

雖然目前關(guān)于自噬與缺血性腦卒中的研究較少，但大量研究表明自噬和NLRP3炎癥小體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。因此，自噬誘導(dǎo)劑的研發(fā)可能是缺血性腦卒中后NLRP3炎癥小體介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的潛在治療方向，但其具體機制仍需進一步研究。

2.3 其他參與調(diào)控NLRP3炎癥小體信號通路的藥物及其作用機制

2.3.1 通過TLR4/NF-κB/NLRP3途徑調(diào)控NLRP3炎癥小體的藥物 原花青素是從葡萄籽中提取的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用[26]。在以右側(cè)頸總動脈閉塞法誘導(dǎo)的大鼠tMCAO模型中[27]，原花青素于大鼠MCAO前1 h灌胃給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原花青素能顯著改善大鼠MCAO/R所致的神經(jīng)功能缺損以及減輕腦水腫和減少腦梗死體積。在體內(nèi)外實驗中，原花青素還能顯著抑制TLR4-p38-NF-κB-NLRP3信號通路的激活以及抑制MCAO/R和OGD/R誘導(dǎo)的IL-1β等炎性細胞因子的釋放，表明原花青素可能通過抑制TLR4-p38-NF-κB-NLRP3信號通路對腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。另有研究表明，在小鼠tMCAO模型模擬腦缺血再灌注損傷模型中，使用純化的花青素提取物(purified anthocyanin extracts，PAEs)治療tMCAO小鼠1周后，測定小鼠腦梗死體積、腦損傷程度以及超氧化物歧化酶等指標，發(fā)現(xiàn)PAEs對小鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能與TLR4/NF-κB和NRFP3信號通路有關(guān)[28]。最近的一項研究證明，在體內(nèi)外腦缺血模型中，抑制免疫蛋白酶體可以降低NLRP3受體蛋白、ASC、caspase-1、IL-1β以及IL-18等NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達，并且降低了NF-κB、焦亡相關(guān)蛋白的水平；此外，在細胞OGD/R模型中，使用NF-κB小分子抑制劑BAY-11-7082可降低NLRP3炎癥小體和caspase-1的表達，提示免疫蛋白酶體可能通過NF-κB途徑誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的表達和激活[29]。

2.3.2 通過AMPK/GSK3β/NLRP3途徑抑制NLRP3炎癥小體的藥物 腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是細胞能量調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶，越來越多的證據(jù)表明，AMPK激活劑可在多種炎癥損傷中發(fā)揮抗炎保護效應(yīng)。最近的研究表明脂聯(lián)素肽(Adiponectin peptide，APNp)通過調(diào)節(jié)AMPK/GSK-3β信號通路減輕腦缺血再灌注后ROS/Trx1/TXNIP相關(guān)的氧化應(yīng)激以及抑制NLRP3炎癥小體的激活，同時發(fā)現(xiàn)APNp對NLRP3炎癥小體的激活是以依賴AMPK的方式實現(xiàn)的，提示APNp在治療缺血性腦卒中方面有很大的臨床應(yīng)用潛力。然而，值得關(guān)注的是，實驗中發(fā)現(xiàn)APNp與其受體脂聯(lián)素受體-1在大多數(shù)星形膠質(zhì)細胞中有共定位現(xiàn)象，提示APNp的抗炎作用可能是通過作用于星形膠質(zhì)細胞實現(xiàn)的[30]。此外，有研究報道高車前素也可以通過調(diào)節(jié)AMPK/GSK3β信號通路，抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細胞焦亡，從而減輕腦缺血再灌注損傷，因此，高車前素可能是針對缺血性腦損傷的一種神經(jīng)保護劑[31]。

2.3.3 通過TXNIP/NLRP3通路抑制NLRP3炎癥小體的藥物 在一項使用OGD/R和tMCAO模型分別模擬體內(nèi)外腦缺血再灌注損傷的細胞和動物模型中，發(fā)現(xiàn)microRNA-135a-5p在M2型小膠質(zhì)細胞來源的細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)中高表達，M2型小膠質(zhì)細胞可以介導(dǎo)microRNA-135a-5p進入神經(jīng)細胞，通過抑制硫氧還蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin interacting protein，TXNIP)的表達，進一步抑制NLRP3炎癥小體的激活，從而減輕腦缺血再灌注損傷[32]。過氧化物酶體增殖物激活受體-β/δ激動劑GW0742已被證實在多種疾病中具有抗炎作用，Marcin Gamdzyk等人證明，在大鼠缺血缺氧(hypoxia-ischaemia，HI)模型和細胞OGD模型中，GW0742可以抑制由TXNIP/NLRP3途徑介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[33]。香膠甾酮(Z-Guggulsterone，Z-GS)是一種類固醇化合物，現(xiàn)已被證明對動脈粥樣硬化、高脂血癥和癌癥等多種疾病有效[34]。在一項以大鼠MCAO模型探討Z-GS對缺血性腦卒中具體作用機制的研究中，使用微陣列分析，共鑒定出8276個差異表達基因，隨后通過趨勢分析篩選出TXNIP和NLRP3為潛在的靶基因。此外，Z-GS還成功地抑制了OGD神經(jīng)元模型的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，TXNIP基因敲除可顯著降低OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元中NLRP3炎癥小體的表達。因此，Z-GS通過抑制TXNIP/NLRP3軸減輕缺血性卒中后的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，有望成為未來治療缺血性腦卒中的候選藥物[35]。

3 結(jié)局及展望

綜上所述，NLRP3炎癥小體是介導(dǎo)缺血性腦卒中后炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵媒介。越來越多的證據(jù)表明，從不同水平抑制NLRP3炎癥小體的活化可顯著減少腦梗死體積和改善預(yù)后。NLRP3炎癥小體的發(fā)現(xiàn)為研究缺血性腦卒中的分子機制提供了新的途徑，從不同水平調(diào)控NLRP3的組裝、表達和激活可能為挽救缺血半暗帶和改善缺血腦卒中后神經(jīng)功能惡化提供新的思路。然而，目前NLRP3炎癥小體與缺血性腦卒中的研究大多集中在動物模型及體外實驗，靶向抑制NLRP3炎癥小體是否對人體有效以及何時啟動靶向治療，仍需大量的實驗和臨床驗證。相信隨著NLRP3炎癥小體激活機制研究的不斷深入，缺血性腦卒中的治療會迎來新的機遇。