Pin1 通過調控脂質代謝關鍵酶影響宮頸癌細胞的增殖及凋亡

海 燕，美力班·吐爾遜，阿仙姑·哈斯木

（新疆醫科大學基礎醫學院/新疆地方病分子生物學實驗室，新疆 烏魯木齊 836001）

宮頸癌作為第四大全球女性常見癌癥，約占所有每年因癌癥死亡女性人數的8%[1]。宮頸癌晚期患者主要的死亡原因是由于腫瘤細胞生長速度過快及難以控制的遠處淋巴結轉移[2]。而過度的細胞增殖及凋亡水平不平衡化在腫瘤萌發過程中發揮著中流砥柱的作用[3]。據報道，在腫瘤的惡性增殖過程中，血管生成不足，腫瘤微環境具有缺氧、酸性、營養貧乏的特點，因此，腫瘤細胞必須調整能量代謝以應對這種不利的微環境，并維持腫瘤細胞的快速生長和增殖[4]。其中，腫瘤細胞中脂質代謝的改變在惡性程度較高的腫瘤中尤為活躍[5]。既往研究表明，非癌性宮頸組織、浸潤前發育不良的宮頸上皮和浸潤性宮頸癌中的脂滴逐漸增加[6]。

Pin1 是肽基脯氨酰異構酶（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，PPIase）家族的成員，在許多癌癥中過表達，其通過破壞原癌基因和腫瘤抑制因子之間的平衡來促進腫瘤發生，并激活許多癌癥驅動途徑促進腫瘤的惡性增殖[7]。據報道，Pin1 是脂質親電體修飾的靶標[8]，被視為治療血脂異常及相關疾病的靶點[9]。乙酰輔酶A 羧化酶1（acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1）可通過催化乙酰輔酶A 轉化為丙二酰輔酶A，被脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）所利用進而調節脂肪酸從頭合成，從而滿足腫瘤細胞的能量供應，在腫瘤的脂質代謝調節過程中至關重要[10]。課題組前期研究發現，Pin1 能夠促進宮頸癌細胞內的中性脂肪含量[11]。然而Pin1 在宮頸癌脂質代謝中的作用機制并未明確，Pin1 是否通過參與調節脂質代謝關鍵酶影響宮頸癌細胞的增殖和凋亡尚待研究。本實驗以宮頸癌SiHa 細胞為研究對象，建立了shPin1 穩轉細胞系，檢測Pinl 和 ACC1，FASN 蛋白表達水平，并分析Pin1 對宮頸癌細胞惡性增殖及凋亡能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

人宮頸癌細胞系購買于普諾賽公司；慢病毒由吉凱公司構建；DMEM 培養基、青霉素-鏈霉素及胰酶（Hyclon）；胎牛血清（Gibico）；ACC1、FASN、Caspase-8、BCL-2、GAPDH 抗體（Abcam）；C-myc 抗體（ZENBIO）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與處理慢病毒轉染前將一定數量細胞接種于六孔板中，按照吉凱公司提供的說明書進行轉染。實驗分組為對照組（sh-NON）、敲低組1（shPin1-1）和敲低組2（shPin1-2）。

1.2.2 實時熒光定量PCR 實驗轉染后的細胞生長至一定密度時，提取細胞內總RNA，參照試劑盒提供的說明書對得到的RNA 進行逆轉錄，通過實時熒光定量PCR 法檢測分析各基因表達水平，β-actin 為內參，實驗重復3 次。引物序列，見表1。

表1 qRT-PCR 檢測基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR detection genes

1.2.3 Western blot 實驗待細胞狀態良好且生長至一定密度時，提取細胞總蛋白，將得到的樣品進行免疫印跡檢測，ECL 顯色法于凝膠成像系統上顯影拍照，實驗重復3 次。

1.2.4 平板克隆實驗6 孔板中接種1 000 個細胞，隔天換液，培養12d，觀察細胞生長情況，固定、染色并采圖，實驗重復3 次。

1.2.5 CCK-8 實驗將SiHa 細胞接種于96 孔板中，每組設5 個復孔，培養24 h 后加入CCK-8工作液，酶標儀OD450，實驗重復3 次。

1.2.6 流式細胞術收集細胞沉淀，PBS 洗3 次，每孔加入500 μL 1×Binding Buffer 工作液和5 μL AnnexinV-PE、5 μL AnnexinV-7AAD，混勻后上機檢測，實驗重復3 次。

1.2.7 GEPIA.2（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）用于分析ACC1、FASN 在宮頸癌及非腫瘤組織中的表達情況。

1.3 統計學處理

GraphPad Prism 8.0 軟件用于統計分析。采用獨立樣本t檢驗對兩組數據進行比較，以均數±標準差描述，采用單因素方差分析方法分析各組間數據，當P＜ 0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Pin1 在宮頸癌中的表達

Western Blot 檢測Pin1 蛋白在Hela、SiHa、H8 細胞的表達，結果顯示Pin1 蛋白在宮頸癌細胞中高表達，且在SiHa 細胞中表達水平最高（P＜0.05），見圖1，故選取SiHa 細胞進行Pin1 低表達慢病毒的轉染。

圖1 Pin1 蛋白在宮頸癌及正常宮頸上皮的表達情況Fig.1 The Expression of Pin1 protein in cervical cancer and normal cervical epithelium

2.2 慢病毒轉染效率的測定

Western Blot 實驗和實時熒光定量 PCR 實驗檢測shPin1-NON 組、shPin1-1 組和shPin1-2 組細胞中Pin1 蛋白和mRNA 的表達情況。結果顯示shPin1-1 組和shPin1-2 組Pin1 蛋白和mRNA表達均顯著低于shPin1-NON 組。結果提示Pin1表達水平被有效下調（P＜ 0.05），見圖2。

圖2 檢測Pin1 慢病毒轉染效率Fig.2 Detection of Pin1 lentiviral transfection efficiency

2.3 Pin1 對宮頸癌脂質代謝關鍵酶的影響

通過GEPIA2 分析了來自TCGA 數據庫的宮頸癌和正常宮頸組織RNA 測序數據中ACC1、FASN mRNA 的表達。結果顯示，宮頸癌中ACC1、FASN mRNA 表達水平高于非腫瘤宮頸組織（P＜0.05），見圖3A。且課題組前期研究發現，宮頸癌組織中 Pinl 與ACC1 蛋白的表達呈正相關[10]。qRT-PCR 和Western Blot 檢測shPin1-NON 組、shPin1-1 組和 shPin1-2 組中 ACC1、FASN mRNA 和蛋白表達情況，結果顯示shPin1-1 組和shPin1-2 組ACC1、FASN mRNA 和蛋白表達均顯著低于shPin1-NON 組（P＜ 0.05），見圖3B、圖3C、圖3D。以上結果提示，協調Pin1 的表達可有效降低宮頸癌細胞中脂質合成原料的含量，從而抑制脂肪酸合成關鍵酶的表達進而抑制細胞內脂質的蓄積。

圖3 shPin1 對宮頸癌SiHa 細胞脂質代謝關鍵酶的影響Fig.3 The effect of shPin1 on key enzymes in lipid metabolism in SiHa cells of cervical cancer

2.4 Pin1 對SiHa 細胞增殖、凋亡及其相關蛋白的影響

Western Blot 結果顯示，BCL-2、C-myc 蛋白表達隨著Pin1 的下調被抑制而Caspase-8 蛋白表達則被上調，見圖4A、圖4B；CCK-8 及平板克隆實驗結果顯示，集落形成能力，見圖4C 及細胞增殖能力，見圖4D，均隨著Pin1 的下調而降低，而流式細胞術結果顯示，細胞總凋亡率呈現上升趨勢，見圖4E。以上結果提示，下調Pin1可有效抑制細胞增殖能力并上調細胞凋亡率（P＜0.05）。

圖4 下調Pin1 后宮頸癌SiHa 細胞增殖和凋亡情況Fig.4 Proliferation and apoptosis of SiHa cells in cervical cancer after downregulation of Pin1

3 討論

目前，測試并應用了各種分子生物學、遺傳學和免疫組織化學研究宮頸癌發生機制的方法，靶向抗腫瘤藥物以及診斷、預后和預測生物標志物尚處探索階段。宮頸癌發病機制的許多問題尚未得到充分研究，許多表征宮頸癌發生各個階段的生物標志物的作用仍不清楚[12]。

Pin 基因位于染色體19p13.2 上，由N 端蛋白質結合WW 域和C 端 PPIase 域組成編碼Pin1 異構酶，可使pSer/Thr-Pro 基序中的脯氨酰鍵異構化。Pin1 最初被證實為參與細胞周期進程，但越來越多的證據表明Pin 介導的脯氨酰異構化在多種生物過程中起著至關重要的作用[13]。本研究檢測了2 種宮頸癌細胞系（Hela、Siha）和正常宮頸上皮細胞系中Pin1 蛋白的表達情況，結果發現Pin1 在Hela、Siha 細胞中均呈高表達，提示Pin1 可能與宮頸癌的進展相關。

腫瘤細胞的惡性增殖及凋亡抑制是腫瘤不良預后的始動因素。據報道，Pin1 可通過破壞促凋亡和抗凋亡信號轉導及增殖促進因子和增殖抑制因子的平衡，促進腫瘤的發生、發展和對細胞死亡的抵抗，并實現復制永生化[14]。在胃癌細胞中，Pin1 可以通過靶向BRD4 以調節細胞增殖[15]。本研究發現，下調Pin1 后，宮頸癌Siha 細胞的增殖能力明顯被抑制，凋亡水平顯著上升；Pin1 的表達水平與增殖相關蛋白c-myc 及抗凋亡相關蛋白Bcl-2 正相關，而與促凋亡相關蛋白Caspase-8 負相關，揭示了Pin1 對宮頸癌細胞增殖及凋亡的重要影響。脂質代謝失調是癌癥中最突出的代謝改變之一。癌細胞利用脂質代謝來獲取能量、生物膜成分和增殖、存活、侵襲、轉移以及對腫瘤微環境影響和癌癥治療的反應所需的信號分子[16]。據報道，脂質代謝的紊亂會干擾腫瘤細胞的致癌途徑，并通過分泌相關代謝因子干擾正常細胞群[17]。本研究發現，宮頸癌細胞中，沉默Pin1 可下調脂質代謝關鍵酶ACC1、FASN 的表達，提示Pin1 可能通過影響脂質代謝途徑影響宮頸癌細胞的增殖及凋亡。后續我們將進一步研究Pin1對脂質代謝途徑中脂質合成原料的生成及脂肪酸攝取能力的影響等方面分析Pin1 對宮頸癌細胞增殖、凋亡的作用機制，為宮頸癌的靶向攻克治療提供一定的理論基礎。