Car-R/Ceph-S 的銅綠假單胞菌OprD 基因突變分析

鄭 喜 ，馬金珠 ，李琴春 ，高 瑜 ，潘 穎 ，宋貴波

（1）云南中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科，云南 昆明 650041;2）昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科/云南省檢驗醫學重點實驗室/云南省醫學檢驗臨床醫學研究中心，云南 昆明 650032）

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是一種適應性很強的非發酵革蘭陰性細菌，能夠引起肺部感染、泌尿系統感染、燒傷創面感染等[1]。其耐藥機制復雜，對多種抗菌藥物具有固有耐藥性，從而使得可選擇用于治療相關感染的抗生素減少[2]。碳青霉烯類抗菌藥物在治療由銅綠假單胞菌引起的感染中起著重要作用[3]。但如今在中國的醫院中銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥物有著較高的耐藥率，2019 年CHINET 三級醫院細菌耐藥監測顯示銅綠假單胞菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別是27.5%和23.5%[4]。導致銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機制復雜，以往的研究報道[5]OprD基因的突變、插入和/或缺失是導致碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的常見機制。本研究對銅綠假單胞菌中一種少見的耐藥表型：對碳青霉烯類耐藥而對頭孢菌素敏感（Car-R/Ceph-S）的銅綠假單胞菌的OprD基因序列進行分析，進而對OprD基因突變情況進行研究和探討。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

樣本收集來自2021 年1 月至2021 年3 月昆明醫科大學第一附屬醫院不同住院患者的痰、引流液、分泌物等標本分離的非重復菌株10 株。經質譜儀（德國布魯克公司）鑒定均為銅綠假單胞菌。經Vitek 2 Compact 藥敏鑒定系統及配套的GN09藥敏板卡檢測為美羅培南、亞胺培南耐藥，頭孢他啶和頭孢吡肟敏感的分離株10 株，分別標記為P1 至P10。將菌株分離培養后用滅菌的牛奶凍存管凍存。

1.2 主要儀器及試劑

Vitek 2 Compact 藥敏鑒定系統以及配套試劑GN09 藥敏板卡購自法國生物梅里埃公司、MH 瓊脂平板購自鄭州安圖生物有限公司、哥倫比亞血瓊脂平板購自鄭州安圖生物有限公司、藥敏紙片購自英國OXOID 公司、電泳儀購自北京六一生物科技有限公司、DNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司、質譜儀購自德國布魯克公司、PCR 儀購自西安天隆科技公司、PCR 試劑購自北京寶日醫生物技術有限公司、凝膠成像儀購自通用電氣（中國）醫療集團公司。

1.3 藥敏試驗

采用Vitek 2 Compact 自動儀器法和紙片擴散法進行試驗。抗生素包括頭孢他啶、亞胺培南、頭孢吡肟、美羅培南、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環丙沙星、左氧氟沙星。根據美國臨床和實驗室標準化委員會（CLSI）2020 年的折點對結果進行判讀[6]。以銅綠假單胞菌ATCC 27853 為質控菌株。

1.4 OprD 基因擴增

將凍存的菌株復融后用哥倫比亞血平板轉種備用。嚴格按照試劑盒廠家說明書提取細菌DNA。根據相關文獻[7]設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：OprD-R：5'-GTCG ATTACAGGATCGACAG-3'；OprD-F：5'-CGCCG ACAAGAAGAACTAGC-3'，片段大小為1 412 bp。

聚合酶鏈反應擴增 PCR 反應體系：50 μL。其中，Emerald Amp MAX PCR Master Mix（2×Premix）25 μL，引物OprD-F、OprD-R 各2 μL，無菌水16 μL，DNA 模板5 μL。PCR 反應條件：（1）預變性：95×5 min；（2）循環：95 ℃×30 min，61 ℃×30 min，72 ℃×90 min，共30 個循環；（3）延伸：72 ℃×10 min；（4）4 ℃保存。產物電泳：用2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳時間20 min。最后在凝膠成像系統上觀察結果并保存圖片。

1.5 PCR 產物測序

將獲得的PCR 擴增產物送北京擎科生物技術有限公司進行Sanger 測序分析，并用DNAstar 序列分析軟件將核苷酸序列翻譯成氨基酸鏈，再與銅綠假單胞菌PAO1 菌株的OprD 蛋白序列作比對分析。

2 結果

2.1 Car-R/Ceph-S 銅綠假單胞菌的耐藥特點

10 株受試菌株對亞胺培南和美羅培南均表現為耐藥，對頭孢他啶、頭孢吡肟和阿米卡星均表現為敏感。未發現對哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦耐藥的菌株，10 株菌株對哌拉西林中介率為20%（2/10），對哌拉西林/他唑巴坦中介率為10%（1/10）；對其余抗菌藥物的耐藥率分別為：左氧氟沙星60%（6/10）、環丙沙星70%（7/10）、氨曲南30%（3/10）、慶大霉素10%（1/10）、妥布霉素20%（2/10）。PA 對各種抗生素的耐藥率，見表1。

表1 PA 對12 種抗生素的耐藥率（n=10）Tab.1 Resistance rate of PA to 12 antibiotics（n=10）

2.2 PCR 產物電泳

對10 株菌株PCR 產物電泳顯示，所有菌株均出現明顯的OprD 條帶，10 株菌株中有6 株OprD 的條帶在1 500 bp 左右；而有4 株（P5、P6、P8、和P10）的OprD 電泳條帶大概在1 000 bp 左右，推測這4 株菌株可能存在大片段的缺失。10株菌株電泳條帶，見圖1。

圖1 10 株銅綠假單胞菌OprD 的擴增條帶Fig.1 Amplified bands of OprD of 10 Pseudomonas aeruginosa strains

2.3 測序分析

10 株菌株經測序后與標準菌株PAO1 的序列比較分析后顯示有不同的突變類型：有2 株菌株（P1 和P2）因堿基缺失導致移碼突變；4 株菌株（P5、P6、P8 和P10）有大片段缺失，均為466～830 位點大片段缺失；2 株菌株（P3 和P9）提前出現終止密碼子。10 株菌株的具體突變類型及突變特征，見表2。

表2 10 株銅綠假單胞菌OprD 基因突變分析Tab.2 Analysis of OprD gene mutation in 10 strains of Pseudomonas aeruginosa

3 討論

10 株菌株藥敏實驗結果顯示：除了對亞胺培南和美羅培南均表現為耐藥，對頭孢他啶、頭孢吡肟均表現為敏感外，PA 對其余抗生素耐藥率為0%～70%，與2019 年CHINET[5]所報道的耐藥率4.6%～27.2%有較大差異，分析原因可能有以下2 點：（1）本研究在選擇菌株時有要求，必須是Car-R/Ceph-S 的銅綠假單胞菌；（2）與參與本次研究的菌株數量少有關。這些可能原因需要在以后的研究中增加菌株數量予以驗證。電泳結果顯示10 株菌株均有明顯的OprD 條帶，未發現有OprD基因的完全缺失，這與李飛等[8]所報道的2.73%的缺失率有差異，可能是菌株數量少所致。

測序分析顯示：在10 株Car-R/Ceph-S 的銅綠假單胞菌中OprD基因存在以下幾種類型的突變模式：一種是點突變，導致過早出現終止密碼子；第二種是移碼突變，插入或缺失一個或多個核苷酸；最后一種是堿基片段的缺失。這與Lee JY 等[9]的報道相似。以往的研究報道[10]OprD基因的替換、缺失、插入或突變等變化可改變OprD 孔蛋白的構象或抑制其存在，并產生對碳青霉烯類抗生素的耐藥性。Sherrard Laura J 等[11]也證實了OprD基因常見的突變都是導致PA 對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要因素。本研究中所有試驗菌株均對亞胺培南和美羅培南耐藥，對所有試驗菌株的OprD基因序列分析顯示：試驗菌株的OprD基因中有堿基的缺失或突變，導致OprD基因中出現移碼突變或終止密碼子的提前出現，這與Hirabayashi 等[12]的研究一致。P4 菌株的OprD基因序列中有9 個氨基酸替代（T103S K115T F170L E185Q P186G V189T Q310E A315G G425A）與國內的研究[13-14]一致。與此外本研究也發現了一些新的氨基酸替代突變（D43N S57E S59R V127L V359L）。結合對10 株Car-R/Ceph-S 銅綠假單胞菌OprD基因的PCR 擴增結果和測序分析，筆者發現有4 株菌株（P5、P6、P8、P10）擴增后條帶在1 000 bp 左右，測序后發現4 株菌株均有466～830 位點大片段缺失以及3 個氨基酸替代（S57E S59R V127L）；所以，筆者推測466-830 位點大片段缺失以及3 個氨基酸的替代可能是導致該表型的2 種重要突變，并且是同時發生的。在本研究中，有8 株菌株OprD基因序列都有氨基酸的替代突變，筆者推測，這種類型的突變可能導致OprD 孔蛋白的空間結構發生改變，從而導致耐藥現象的出現。另外，有2 株菌株（P3、P9）因突變使得終止密碼子（TGA）的提前出現。有研究[9]顯示：在OprD基因中過早出現終止密碼子可以抑制OprD 孔蛋白的存在，導致產生的OprD肽鏈異常縮短，OprD 孔蛋白功能喪失。大量研究表明這也是導致銅綠假單胞菌對碳青霉烯類（主要是亞胺培南）耐藥的重要原因。

綜上所述，OprD基因在Car-R/Ceph-S 的銅綠假單胞菌中起著重要作用；OprD基因的替換、缺失或插入突變等變化可改變OprD 孔蛋白的構象或抑制其存在，并產生對碳青霉烯類抗生素的耐藥性。本研究發現在Car-R/Ceph-S 的銅綠假單胞菌中，OprD基因存在不同類型的突變，其中466～830 位點大片段缺失以及3 個氨基酸（S57E S59R V127L）的替代這兩種同時出現的突變類型是有較大價值的，由于本次研究的菌株數量少，尚需進一步以大數量樣本研究予以驗證以及開展深入的耐藥機制研究。此外，關于該特殊耐藥表型的銅綠假單胞菌方面的研究較少，本研究結果可為此類型的研究提供參考。