基于新生兒臍血TEL-AML1 融合基因檢測的兒童急性白血病篩查體系的建立及意義

趙亞玲 ，武 坤 ，黃 蓉 ，何根婭 ，丁臻博 ，張彩營

（1）昆明醫科大學第一附屬醫院兒科;2）醫學檢驗科;3）產科，云南 昆明 650032）

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童白血病中最常見的類型。雖然兒童白血病治療有85%～90%的長期生存率，但大多數治愈的兒童面臨長期化療藥物副作用，復發性ALL 的預后仍然不令人滿意，僅40%的長期生存率[1-2]，因此，兒童急性白血病早期篩查體系的建立對預防和早期診斷將具有重要意義。兒童白血病的一個重要特征為基因組的不穩定性，表現為染色體的重排、缺失、多倍體等。TELAML1 融合基因伴隨的t（12;21）（p13;q22）染色體異常被認為是兒童ALL 中最常見的細胞遺傳學異常，在不同國家或地區的兒童ALL 發病者中陽性率可達到20%～30%[3]。大量回顧性分析B-ALL患兒早期保留的新生兒血液斑點卡發現TELAML1 融合基因早在胎兒造血期就已形成[4]，這提示TEL-AML1 融合基因的異常發生于白血病患兒出生前，因此，對新生兒臍血TEL-AML1 融合基因的檢測有助于急性白血病的早期篩查。本研究旨在通過RT-PCR 方法檢測新生兒臍血TELAML1 融合基因，構建兒童急性白血病篩查體系，并探討其臨床意義，為臨床上開展早期篩查兒童急性淋巴細胞白血病提供依據。

1 資料與方法

1.1 病例資料

1.1.1 研究對象本研究選擇2018 年1 月至2021 年1 月在昆明醫科大學第一附屬醫院產科出生的健康新生兒2 480 例作為研究對象。上述研究對象必須同時滿足下列條件[5]：（1）單胎；（2）胎齡≥37 周；（3）家長同意加入研究，并能堅持隨訪；（4）母親能用中文回答問卷調查；（5）孕期至分娩期間一直居住在昆明；（6）母親妊娠期間定期在昆明醫科大學第一附屬醫院產檢。

1.1.2 高危新生兒篩選本研究首先通過問卷調查，篩選出具有發生兒童急性白血病高危因素的人群。高危因素：（1）母親高齡：年齡大于40 歲；（2）母親或父親吸煙；（3）出生體重大于4 000 g；（4）家族中有白血病腫瘤病史；（5）家庭新裝修。

本研究獲得昆明醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準及新生兒家長的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 問卷調查通過問卷調查方式篩選出高危新生兒，根據研究顯示母親高齡、母親或父親吸煙、出生體重大于4 000 g、家族中有白血病腫瘤病史、家庭新裝修的新生兒，其白血病發生風險高于同齡兒童[6-8]，問卷設計新生兒及母親資料、父母主要環境暴露因素信息及腫瘤家族病史等3個方面，并對其進行信及度效度分析。本研究采用內容效度來評價問卷的效度，采用專家評分和因子分析評估；信度采用Cronbach’s α 系數評估。白血病高危新生兒調查問卷題項水平的內容效度指數為0.85～1.00，Cronbach’s α 系數為0.83，提示白血病高危新生兒調查問卷具有良好的信度及效度。本研究共有1870 例新生兒接受調查，共回收1 500 份問卷，有效問卷1 200 份。

1.2.2 標本收集經家屬和孕婦本人的同意，由課題組指定的專人來負責收集出生時臍血5 mL，所有標本均用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝處理。所有標本均來源于昆明醫科大學第一附屬醫院產科2018 年1 月至2021 年1 月出生的新生兒，共收集231 份標本。

1.2.3 儀器與試劑人外周血淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司）；生理鹽水（昆明南疆制藥有限公司）；TRIzol 試劑（TaKaRa 公司）；白血病融合基因檢測試劑盒（TEL-AML1 二步法）（上海源奇生物醫藥科技有限公司，批號：20200418）；異丙醇、氯仿（重慶川東化工有限公司）；無水乙醇（安徽安特食品固粉有限公司）；RAase-free Water（TaKaRa 公司）；無酶無菌水（Solarbio 公司）；75%乙醇用無酶無菌水水配置。

SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺（蘇州凈化）；L535R 低溫離心機（湘儀）；SORVALL LEGEND MICRO 17R 高速冷凍離心機（Thermo 公司）；PCR Thermai Cycler Dice TP600（TaKaRa 公司）；7500 Real Time PCR system（Applied Biosystems 公司）。

1.2.4 RNA 提取方法（1）單個核細胞收集在出生后12～24 h 內，從健康足月新生兒的臍帶血（umbilical cord blood，UCB）樣本中分離出單核細胞（mononuclear cells，MNCs）以減少細胞和/或mRNA 的降解。將乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血顛倒混勻后用吸管沿管壁緩慢加入裝有6 mL 人外周血淋巴細胞分離液的試管中，3 000 r/min 離心15 min，轉移中間白膜層到裝有6 mL 生理鹽水的新試管中，3 000 r/min 離心15 min，棄上清，留取沉淀；（2）總RNA（mRNA）提取 MNCs 計數 ≥25×106，提取mRNA，分成2 管，在-80 ℃下保存備用。取400 μL 富集的單個核細胞立即加入600 μL Trizol 試劑，充分混勻后，室溫放置10 min，加入400 μL 氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，轉移上層水相到新管中，加入600 μL 異丙醇沉淀水相中的RNA，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，棄去上清，用 1 mL 75% 乙醇洗滌RNA 沉淀，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，室溫放置干燥RNA 沉淀，加入100 μL RAase-free 水，溶 解RNA；（3）PCR 擴增 逆轉錄PCR 儀采用TaKaRa公司的PCR Thermai Cycler Dice TP600，反應體系為：6 μL MIX1+4 μL MIX2+10 μL RNA；PCR逆轉錄條件為：37 ℃，60 min；70 ℃，10 min；4 ℃保存。實時熒光定量PCR 儀使用ABI 公司的ABI7500，定量反應體系為：7 μLTEL-AML1 MIX/內參基因MIX+13 μLPCR MIX+5 μLcDNA模板量；PCR 循環參數為：42 ℃，5 min，94 ℃，3 min；（94 ℃，15 sec，60 ℃，60 sec）40 個循環。在循環第二步60 ℃時收集熒光信號，檢測通道為FAM-TAMRA，參比熒光設定為none；（4）熒光PCR 標準曲線繪制及各樣本融合基因拷貝數測定 在PCR 反應結束后，設定基線水平和閾值，ABI7500 軟件會自動繪制標準曲線及擴增曲線（圖1A、圖1B），并根據標準曲線計算各樣本融合基因和內參基因的絕對拷貝數，目的融合基因與內參基因的拷貝數比值需自行計算；（5）存儲的mRNA 標本TEL-AML1 融合基因檢測 為排除實驗假陰性，通過對存儲的231 例mRNA 標本再次進行TEL-AML1 融合基因檢測。

圖1 TEL-AML1 標準曲線及擴增曲線Fig.1 TEL-AML1 standard and amplification curve

1.3 統計學處理

采用SPSS17.0 統計軟件進行數據統計。計數資料以例數（n）和率（%）表示；計量資料以均數±標準差（）表示。

2 結果

2.1 新生兒一般資料

平均胎齡為（39±0.6）周，其中男118 例（51.1%），女113 例（48.9%）。

2.2 平均耗費時間

從出生到樣品處理（即MNC 收獲、mRNA 分離）的平均時間為（12.3±0.6 h）（0.5～23.5 h）。

2.3 臍血單核細胞計數

平均為（26.8±0.72）×106（18.2×106～32.8×106），ABL（CtABL）的平均周期閾值為（24.01±0.36）（95%區間：21.49～26.53）。

2.4 TEL-AML 融合基因檢出率

在第1 次篩查中，231 份臍血樣品EL-AML融合基因檢測均為陰性。通過重新篩選存儲的mRNA 都無法確認陽性信號。

2.5 平均費用、患者滿意度及接受率

平均費用為每份標本200 元，患者滿意度及接受率均為100%。

3 討論

兒童急性白血病的發展是由2 種遺傳異常的積累所驅動的多步驟的過程。原發性異常或“第一次命中”代表一個初始事件，通常是染色體易位產生白血病前基因融合，具有損害造血干細胞/祖細胞分化的新活性，這些基因融合主要發生在子宮內的胎兒造血過程中，產生一個持續但臨床隱蔽的白血病前克隆[9-10]，因此，臍帶血融合基因的篩查對于制定兒童白血病的預防和治療策略具有重要意義[11]，基于以上理論，本研究建立了以檢測新生兒臍血TEL-AML1 融合基因為基礎的兒童急性淋巴細胞白血病早期篩查體系，并成功將其應用到臨床中。

本篩查體系包括2 部分：高危人群篩選及臍血TEL-AML1 融合基因檢測。（1）在母親分娩前通過問卷調查方式篩選出高危人群。研究顯示母親高齡、母親或父親吸煙、出生體重大于4 000 g、家族中有白血病腫瘤病史、家庭新裝修及試管嬰兒的新生兒，其白血病發生風險高于同齡兒童[6-8]，因此，筆者在問卷調查中將這些因素列為高危因素，具備一項及以上高危因素者即可入組。這表明本研究對象具有很強的針對性，避免了盲目性；（2）收集臍血及融合基因檢測。在此階段，收集新生兒臍血時，必須在出生時斷臍后立即收集臍血，隨后采用RT-PCR 方法，對231 份新鮮臍血標本迅速進行TEL-AML1 融合基因的檢測。與凍存標本相比，新鮮標本的檢測更加準確，耗時更少，費用更低。此外，為了避免假陽性，我們在實驗中采取了嚴格的預防措施，以防止標本污染，將所有臍帶血標本都與可能包含任何被測試轉錄本的材料分開處理，所有步驟均納入陰性對照及陽性對照。其次為了避免假陰性，評估和比較本研究PCR 檢測技術的敏感性水平，筆者對RT-PCR 進行了敏感性測試，靈敏度1×10-5，每個樣本重復3 次。這些措施保證了本研究實驗結果的準確性。

本研究的結果顯示在高危新生兒臍血標本中并未檢測到TEL-AML1 融合基因，分析其原因可能是以下幾方面的原因：（1）樣本量過小，本研究在有限的時間內連續收集到231 份樣本，在大規模篩查實驗中顯得不足，因此，增加研究的樣本量可能會提高其檢出率；（2）PCR 檢測靈敏度也可能影響檢測率，本研究PCR 的敏感性約為10-5。Pavol 等[12]的研究顯示大多數PFG 陽性臍血PFG的數量非常接近RT-qPCR 敏感性閾值，大約每10 萬個細胞達到1～3 個拷貝，該研究結果強調了篩選方法的靈敏度局限性，如果所獲得的數據僅略高于靈敏度水平，則只能對融合基因發生率進行近似估計，這說明PCR 檢測的靈敏度將會對基因的檢出率產生較大的影響，下一步本篩查系統將探索應用新的檢測方法，確保靈敏度至少1×10-6。

復習文獻，筆者發現對新生兒臍血中融合基因的檢測在白血病的篩查中具有很高的應用價值及科學性。2002 年，Mori 等[13]的研究報道臍血中TEL-AML1 的發生率為1.05%，這項研究是第1 個使用 RT-qPCR 在健康個體中檢測PFG 的研究。該方法的靈敏度為10-3～10-4，盡管無法排除首次嵌套式 RT-PCR 中發生交叉污染的風險，但由于該研究具有567 個先證者的驗證，因此報告的結果似乎非常可靠。后來多數研究的結果均顯示TEL-AML1 融合導致染色體易位發生在相對較高的比例（1%）[14-15]，考慮到兒童中TELAML1+ALL 的累積發病率（1：10 000，即0.01%），它預測在100 個攜帶可檢測到的TEL-AML1 轉錄本的新生兒中，只有1 個注定會發展為ALL[16]，這在一定程度降低了臍血篩查融合基因對白血病前克隆存在的意義。Lausten-Thomsen 等[17]的研究小組對這一觀點提出了挑戰，其研究發現可檢測到TEL-AML1 轉錄本的新生兒比例實際上可能要低得多（0.01%），這意味著出生時可檢測到TELAML1 融合的嬰兒最終將可能100%發展為TELAML1 陽性 ALL，顯而易見，臍血融合基因檢出率越低，建立以臍血融合基因檢為基礎的白血病篩查對于防治在ALL 的發生更具有重要意義。

本研究中結果顯示可檢測到TEL-AML1 融合基因的發生率趨勢與Lausten-Thomse 等[17]的研究一致，但明顯低于其他研究，排除使用因素所致假陰性外，越低的檢出率意味著融合基因的發生與急性淋巴細胞白血病發生的相關性越強。事實上，新近的一項研究也得出了與本研究類似的結果[3]，由此可見，并不能因為陰性結果而否定新生兒臍血中融合基因檢測的作用，因此，本研究基于新生兒臍血融合基因檢測而建立的兒童急性白血病篩查體系具有一定的科學性。

總之，本研究成功構建了一種以新生兒臍血TEL-AML1 融合基因檢測為手段的兒童急性淋巴細胞白血病早期篩查體系，在理論上具有科學性，在臨床上具有可行性，耗時短，費用低，接受率高，為臨床上開展早期篩查兒童急性淋巴細胞白血病提供依據。盡管其陽性細胞的頻率和/或水平低于先前報道的水平，但進一步增加樣本量有可能提高TEL-AML1 融合基因的檢出率。此外，增加其它融合基因的檢測將更有助于兒童急性白血病的篩查，下一步本篩查體系將以此為基礎進行完善。