超聲-微波協同輔助優化酸棗果肉多糖提取工藝及抗氧化活性研究

李毅翔,陳芋霏,王艷艷

(黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040)

酸棗為鼠李科棗屬植物酸棗的果實。現代研究表明，酸棗的主要化學成分為黃酮、多糖、生物堿、氨基酸等[1]，其中，多糖具有明顯的降血糖、降血脂、抗炎等作用[2-3]，也是有較強作用的抗氧化成分[4-5]。當前，酸棗多糖主要以蒸餾水作提取溶劑進行提取，文獻報道的方法主要有熱水浸提法、酶解法、微波提取法、超聲提取法[6-8]等。然而，單一的提取方法常具有提取時間較長，耗費資源較多的情況。超聲波提取法利用超聲波對溶劑的空化作用和次級效應，促進植物多糖浸出，但其熱效應不強，需要較長時間才能達到足夠高的提取溫度;微波提取法利用微波能量可迅速達到較高反應溫度，使細胞內的活性成分更易釋放，但傳熱傳質不均勻[9]，將上述2種方法相結合時，具有高效率低能耗、生物活性好的優點。目前，已有將兩者聯合應用于植物天然成分提取的報道[10-11]，但尚未涉及酸棗多糖，且不同提取溶劑對成分的提取也有較大影響。因此，本研究通過超聲-微波協同提取酸棗果肉多糖，優化提取工藝，并考察該成分的抗氧化活性，為充分利用酸棗資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸棗：采自山東省臨沂市，去核。果肉于50℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎過50目篩，風干后密封，置4℃冰箱中保存，備用。

試劑(均為分析純)：水楊酸、雙氧水、鉬酸銨、磷酸三鈉，天津永晟精細化工有限公司；硫酸亞鐵、無水葡萄糖、維生素 C，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DPPH，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司。

1.2 儀器與設備

分析天平(MS105),梅特勒-托利多儀器有限公司；數控超聲波清洗器(KQ-500DB),昆山超聲儀器有限公司；常壓微波合成工作站(MAS-II),上海新儀微波化學科技有限公司；酶聯免疫檢測儀(Synergy MX),美國BIOTEK公司。

1.3 方法

1.3.1 不同提取方法對酸棗多糖提取率的影響 (1)超聲輔助提取酸棗多糖:在酸棗果肉粉末中按一定料液比加提取溶劑，置于超聲波提取器中，超聲溫度50℃、超聲波功率設為400 W、超聲25 min、提取液3 000 r/min離心10 min取上清液得酸棗多糖提取液。(2)微波輔助提取酸棗多糖:在酸棗果肉粉末中按一定料液比加提取溶劑，置于常壓微波合成儀中，微波功率200 W、微波時間3 min,取出后冷卻，3 000 r/min離心10 min取上清液。(3)超聲-微波協同提取酸棗多糖:采用超聲-微波協同提取的方式，考察二者協同順序對實驗的影響。微波-超聲提取法具體工藝流程：去核酸棗粉末按料液比1 ∶30分別加入不同提取溶劑，200 W微波提取2 min再在50 ℃下400 W超聲提取25 min,3 000 r/min離心10 min取上清液得酸棗多糖提取液；超聲-微波提取法則先進行超聲，而后進行微波。

1.3.2 單因素試驗 依據1.3.1 試驗方法，考察不同提取溶劑、超聲溫度、料液比、超聲時間對微波-超聲聯合協同提取酸棗多糖得率的影響。在試驗過程中，各因素的考察范圍：蒸餾水與pH值分別為4、5、6、7、8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；超聲溫度30、40、50、60、70 ℃；超聲功率300、350、400、450、500 W；料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g/mL)；超聲時間5、10、15、20、25 min。考察協同提取順序，先微波提取再超聲輔助提取酸棗多糖得率較高，工藝優化以低能耗、高得率為目的，所以在研究其中單因素變量的影響時，其他各因素固定的條件為pH=7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，超聲溫度50℃、料液比1 ∶30，先200 W微波2 min再400 W超聲提取25 min。

1.3.3 響應面分析試驗與酸棗多糖提取工藝的優化 在單因素試驗基礎上，確定超聲-微波協同方式為先微波后超聲，固定提取溶劑pH=7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液,依據Box-benhnken 中心組合試驗設計原理，以超聲溫度、料液比和超聲時間3個因素為自變量，設計3因素3水平共計17個試驗點的響應面分析試驗(表1)。

表1 響應面分析因素的因素與水平

1.3.4 酸棗中多糖的測定 酸棗果肉中多糖含量的測定參照姜瓊等[12]優化后的方法，并稍作修改。精密吸取酸棗多糖提取液60 μL置于微量離心管中，加入180 μL顯色液(5%苯酚溶液與98%濃硫酸按體積比為1 ∶5混合)，充分渦旋，在沸水浴中加熱25 min。冷卻至室溫，以加入與樣品溶液同濃度乙醇為空白，在490 nm波長處測定吸光度，以葡萄糖為標準品，得到標準曲線y=3.575 6x + 0.169 9，結果顯示，葡萄糖在0.049～0.295 mg/mL 與吸光度線性關系良好(R2=0.999 6)，其中x為葡萄糖質量濃度(mg/mL)、y為吸光度。根據標準曲線計算酸棗多糖質量濃度，并按式(1)計算多糖得率。

酸棗多糖得率(%)=[(n×C×V)/m]×100(1)

式(1)中，n為稀釋倍數、C為待測樣品的濃度、V為準確移取待測樣品的體積、m為準確稱取多糖樣品質量。

從出土文獻看，《居延新簡》的《四時簿》《月言簿》中，明確記錄了考核地方官員的標準，其中非常重要的一條就是：“務順四時月令”。如EPF59·61號簡：“制詔納言：其令百遼，屢省所典，修厥職，務順時氣。”[14]《居延新簡三》125-126EPF22·50號簡：“部吏毋犯四時禁者，敢言之。”[14]《居延新簡四》58EPF59·161號簡：“會月二日，謹案部燧六所，吏七人，卒廿四人，毋犯四時禁者。謁報，敢言之。”[14]《居延新簡三》138

1.3.5 酸棗多糖的抗氧化性分析 酸棗多糖提取物和維生素 C 的濃度梯度分別為質量濃度0.05、0.10、0.2、0.40、0.6、0.8、1.0 mg/mL。參照Yiling Zhu等[13]的方法進行酸棗多糖清除DPPH自由基和羥基自由基能力的測定。清除率計算公式如式(2)、(3)：

DPPH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]× 100

(2)

·OH 清除率(%)=[1-(A1-A3)/A0]× 100

(3)

式(2)、(3)中，A0為空白對照的吸光度、A1為自由基與多糖或陽性對照的吸光度、A2為樣品的本底吸光度、A3為乙醇替代水楊酸乙醇溶液的樣品本底吸光度。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法對酸棗多糖提取率的影響

2.1.1 超聲輔助提取酸棗多糖的得率 如圖1所示，隨著超聲功率的改變，酸棗多糖得率逐漸上升，當超聲功率達400 W時最高(28.64%)，繼續加大超聲功率，得率開始降低，可能是多糖分子在較強機械作用下斷裂，引起提取率的急劇降低[14]；而固定超聲功率，考察超聲時間發現處理時間為25 min時達到最高(28.59%)，繼續延長超聲時間，得率開始顯著降低。延長超聲輔助提取時間有利于植物與提取溶劑充分接觸，但對性質不穩定的活性物質，在長時間高溫條件下處理可能會導致提取率的下降。

圖1 不同超聲功率、超聲時間對酸棗多糖得率的影響

2.1.2 微波輔助提取酸棗多糖的得率 如圖2所示，多糖得率隨著微波功率的增加，當微波功率為200 W時，得率達到最高(31.87%)，但當微波功率再增大時，因為提取體系溫度更高，多糖斷裂，且溶劑持續沸騰，水分快速蒸發，也使產率急速下降；微波處理時間的延長也呈現先上升后下降的趨勢，為微波時間為2 min時得率最大(32.06%)。

圖2 不同微波功率、微波時間對酸棗多糖得率的影響

2.1.3 超聲-微波協同提取多糖的得率 如圖 3A 所示，pH=7的檸檬酸-檸檬酸緩沖溶液作溶劑時，多糖得率最大為41.37%，這是因為不同pH值下多糖中一些特定基團的溶解程度不同[15]，而檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，檸檬酸鈉作為螯合劑，與果膠中的金屬離子結合能力較強，增加了果膠的溶解性[16]，從而相較蒸餾水有更高的提取率；如圖 3B 所示，隨著超聲溫度的提升先增高后降低，適當的溫度能加速多糖的溶出，較高的溫度則會使多糖結構破壞，當提取溫度為60℃時多糖得率最大為41.27%；如圖3C所示，料液比為1：30時多糖得率最高為41.45%。由于微波能量較高，使溶劑在提取過程中逐漸耗失，溶劑和物料間的濃度差不斷改變，當多糖溶出達到平衡時，增加溶劑體積可能降低了超聲的工作效率，進而降低了多糖得率；如圖3D所示，微波-超聲協同提取隨著超聲時間的延長，多糖得率呈先升高后降低的趨勢。超聲15 min時的多糖得率最高，為42.67%。與單一微波和超聲輔助提取方法相比，協同提取縮短了提取時間，且二者聯用所取得的多糖提取率明顯高于超聲提取和微波提取的最高值。

圖3 不同提取條件對酸棗多糖得率的影響

2.1.4 不同提取方法提取多糖得率的比較 由圖4可知，超聲-微波協同提取中，協同順序為微波-超聲的輔助提取法獲得的酸棗多糖提取率最高(39.84%)，超聲-微波輔助提取率次之(37.99%)，單一微波輔助提取的提取率較低(32.06%)，單一超聲輔助提取的提取率最低(28.64%)。微波-超聲協同提取順序的多糖提取率較高，可能因為二者協同作用，先通過微波高效快速穿透薄壁，短時間內達到較高溫度，提高目標組分的擴散能力，再在超聲環境下均勻提取，使細胞壁消融更徹底，短時間內細胞內的活性多糖充分溶出[17]。

圖4 不同提取方法酸棗多糖提取率

2.2 響應面試驗優化提取工藝

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

表3 響應面的方差分析結果

Y=+42.76-0.76A+2.25B+0.15C+0.92AB-0.99AC+0.72BC-1.99A2-1.83B2-3.79C2

(4)

2.2.2 最佳工藝條件及驗證性試驗 求解回歸方程，得到酸棗果肉多糖提取的最佳工藝條件為超聲溫度 58.6℃、料液比為1 ∶39.15(g/mL)、協同提取超聲時間為 15.9 min。預測酸棗多糖的得率 43.49%。為了方便實際試驗操作，將理論條件進行近似處理，超聲溫度 60℃、料液比為1 ∶40(g/mL)、協同提取超聲時間為 16 min。進行驗證性試驗，重復3次平行試驗，得到的結果分別為 43.26%、41.75%、42.81%，其平均值為(42.61±0.78)%，與預測值差異不顯著，說明該工藝具有穩定性和可行性。

2.3 酸棗多糖抗氧化性分析

2.3.1 酸棗多糖對DPPH·清除能力 DPPH·可以捕獲或清除其他的自由基，而被廣泛用于測定試樣的抗氧化能力[19]。由圖5可知，在質量濃度為0.05～1.00 mg/mL 氛圍內，隨著維生素C和酸棗多糖濃度的增加，對DPPH·的清除能力也明顯增加。在酸棗果肉多糖質量濃度1 mg/mL時，對DPPH·的清除率達最大值19.12%，但清除率均小于維生素C，這表明酸棗果肉多糖對DPPH·具有一定的清除效果。

圖5 多糖對DPPH·的清除作用

2.3.2 酸棗多糖對·OH清除能力 ·OH是活性氧中活性最強的一種自由基，可以氧化組織中蛋白質、糖、核酸等生物大分子，損傷細胞的結構與功能，導致機體壞死或突變，因此對羥基自由基清除的清除能力是抗氧化作用的一個重要指標[20]。由圖6可知，對·OH 清除活性隨酸棗多糖質量濃度的增加而逐漸增強，當濃度增大到 0.40 mg/mL 時，維生素C對·OH 清除率接近 100%。當酸棗多糖達1.0 mg/mL時，對·OH的清除率達32.99%，試驗證明酸棗多糖也具有一定的清除·OH 能力。

圖6 多糖對·OH的清除作用

3 討論與結論

以酸棗果肉多糖得率為評價指標，在單因素試驗的基礎上，通過響應面對酸棗多糖微波-超聲提取工藝進行優化，得出多糖的最優提取率為(42.61±0.78)%，與模型的預測值較為接近。與單一超聲輔助提取、單一微波輔助、超聲-微波提取相比，提取率分別增加了13.97%、10.55%、4.62%，且工藝操作簡單，節省提取時間，降低能耗污染，使多糖提取效益最大化。而一定pH值范圍內的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液較蒸餾水也有較強的多糖提取能力。檸檬酸、檸檬酸鈉作為常見的食品添加劑，可應用于食品加工生產中，提高產品風味的同時也能增加有效物質的溶出。體外抗氧化試驗表明，酸棗果肉多糖具有較強的DPPH·和·OH 清除能力，其抗氧化活性隨酸棗多糖濃度的增加而增強。酸棗果肉為中藥酸棗仁的副產品，資源豐富，可作為良好的天然抗氧化劑來源，本研究將為酸棗的綜合利用和相關功能性天然產品的開發與應用等提供科學依據。