佛山市中醫院耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌的產酶型別及耐藥性分析*

吳 英，雷 蕾，劉禮初，張小玲，鐘幸容

廣東省佛山市中醫院檢驗醫學科，廣東佛山 528000

腸桿菌目細菌是臨床上的主要病原菌之一，以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌最常見。碳青霉烯類藥物是治療腸桿菌目細菌感染的首選藥物。然而近年來，常有不合理使用碳青霉烯類藥物的現象，導致耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌(CRE)迅速流行，而且CRE的耐藥性也在逐年遞增。美國疾病預防控制中心(CDC)關于CRE的定義[1]為滿足以下任意一個條件:(1)對亞胺培南、美羅培南(MEM)、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類藥物耐藥;(2)對于天然對亞胺培南敏感性降低的細菌(如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等)，需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結果；(3)產生碳青霉烯酶。

針對細菌耐藥的顯著問題，美國CDC把18種重要耐藥菌分為3個級別：緊急威脅、嚴重威脅和值得關注級別，并在2013年首次將CRE列為對全球公眾健康構成緊急威脅的級別[2]。而到了2019年，CRE仍然被列為緊急威脅的行列。一旦發生CRE感染，病死率高達70%[3]，臨床迫切需要新的抗菌藥物。頭孢他啶/阿維巴坦(CZA)由第三代頭孢菌素頭孢他啶和β-內酰胺酶抑制劑阿維巴坦組成。阿維巴坦的獨特作用機制是通過共價(緩慢可逆)結合和失活β-內酰胺酶來阻止頭孢他啶的水解，具有長效的抑酶作用。本研究旨在研究本院CRE的碳青霉烯酶類別、對CZA等抗菌藥物的耐藥性，CZA與MEM、氨曲南(ATM)的聯合作用。

1 資料與方法

1.1菌株來源 收集佛山市中醫院2020年1月1日至2022年3月1日住院患者臨床標本分離的CRE 95株(剔除同一患者同一部位的重復菌株)，其中分泌物標本46株，尿液標本25株，痰液標本15株，肺泡灌洗液標本4株，腹部引流液、血液、膿液、膽汁、腦脊液各1株。

1.2儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀和VITEK MS質譜儀均購自法國生物梅里埃公司；藥敏卡(AST-N334卡)為配套試劑；MH培養基購于鄭州安圖綠科生物工程有限公司；血瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、營養肉湯購于江門凱林貿易有限公司；藥物敏感試驗(簡稱藥敏試驗)紙片MEM 10 μg、CZA 50 μg、ATM 30 μg均購自英國Oxoid公司。碳青霉烯酶檢測試劑盒購自北京金山川科技發展有限公司。鑒定和藥敏質控菌株有大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)；肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-1705 (KPC型碳青霉烯酶陽性株)、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146 (NDM型金屬β-內酰胺酶陽性株)均購自中國菌種保藏中心。

1.3方法

1.3.1細菌培養及鑒定 臨床標本采集和細菌分離培養嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》[4]進行。菌株由法國梅里埃VITEK MS質譜儀鑒定。

1.3.2生物藥敏試驗 采用AST-N334卡在VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀上進行藥敏試驗，用紙片擴散(K-B)法進行補充。結果判斷標準采用2020年美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)M100最新版本[5]。CZA藥敏試驗采用K-B法，判斷標準是抑菌圈直徑≥21 mm為敏感，≤20 mm為耐藥。CZA與ATM、MEM的聯合藥敏試驗參照K-B法聯合藥敏試驗[6]，兩藥敏紙片之間相隔20～30 mm。結果判斷：根據呈現的抑菌圖形報告協同或無關。改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)和乙二胺四乙酸(EDTA)改良碳青霉烯滅活試驗(eCIM)方法及結果判斷均參照2020年CLSI M100[5]標準進行。

1.3.3膠體金免疫層析法檢測碳青霉烯酶耐藥基因型 快速檢測KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48、OXA-23這6種碳青霉烯酶基因型。按照試劑盒操作：向無菌EP管中滴入10滴標本處理液，用一次性接種環蘸取過夜培養的純菌落，插入滴有標本處理液的無菌EP管中，充分攪拌使其與溶液混勻，取50 μL處理后的標本加至膠體金檢測盒的加樣孔，10 min后讀取結果。在檢測卡的檢測區域中出現2條紅色條帶(檢測條帶和對照條帶)，即結果為陽性；僅出現1個對照條帶表明檢測結果為陰性；如對照條帶未出，說明該檢測無效，需重測。質量控制：試劑盒陽性質控需檢測結果為陽性。

1.4統計學處理 采用Whonet 5.6 軟件進行菌株數量分布和耐藥性統計。采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CRE細菌種類分布 95株CRE菌株中，排名前3位的分別是肺炎克雷伯菌(39株，41.0%)、大腸埃希菌(27株，28.4%)、陰溝腸桿菌復合群(18株，18.9%)。見表1。

表1 CRE細菌種類及構成比

續表1 CRE細菌種類及構成比

2.2CRE主要細菌對常用抗菌藥物的耐藥率比較 95株CRE菌株對頭孢曲松、頭孢呋辛、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率≥90.5%，對阿米卡星的耐藥率≤26.3%，對替加環素的耐藥率≤1.1%。陰溝腸桿菌復合群對亞胺培南、MEM、復方磺胺甲噁唑的耐藥率均低于肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌，對阿米卡星、環丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率低于肺炎克雷伯菌(P<0.05)。見表2。

表2 95株CRE菌株對常用抗菌藥物的耐藥率比較[n(%)]

2.3mCIM、eCIM 檢測結果及碳青霉烯酶耐藥基因型結果 95株CRE中，mCIM試驗陽性菌株93株(97.9%)，不產酶2株(2.1%)，而eCIM試驗陽性菌株49株(51.6%)。檢測93株產酶CRE菌株攜帶的碳青霉烯酶耐藥基因，44株絲氨酸酶菌株中檢出43株攜帶KPC耐藥基因，1株攜帶非KPC耐藥基因；49株產金屬β-內酰胺酶菌株全部檢出攜帶NDM耐藥基因；未檢出攜帶VIM、IMP、OXA-48、OXA-23耐藥基因的菌株。見表3。

表3 mCIM、eCIM的檢測結果和碳青霉烯耐藥基因分布

續表3 mCIM、eCIM的檢測結果和碳青霉烯耐藥基因分布

2.4CZA的K-B藥敏結果及CAZ與MEM、ATM聯合藥敏試驗結果 44株產絲氨酸酶菌株對CZA敏感率為97.7%，49株金屬β-內酰胺酶菌株對CZA敏感率為0.0%，2株不產酶菌株對CZA敏感率為100.0%。對主要CRE菌株CR-KP和CR-ECO進行CAZ與MEM、ATM的聯合藥敏試驗。見表4。

表4 CAZ與MEM、ATM聯合藥敏試驗結果(n)

3 討 論

CRE感染多發生于有嚴重基礎疾病、免疫缺陷和(或)長期反復使用廣譜抗菌藥物的患者，預后差，尤其是CRE血流感染患者[7]。 2021年中國細菌耐藥監測數據顯示，全國碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的檢出率平均值已高達10.9%，肺炎克雷伯菌對亞胺培南和MEM的耐藥率已分別上升至26.4%和28.0%。隨著抗菌藥物的發展和使用，腸桿菌目細菌的耐藥性越來越強，而CRE引起的感染性疾病也威脅著公眾的健康。

本研究中，CRE菌株檢出排名前3位的是肺炎克雷伯菌(39株，41.1%)、大腸埃希菌(27株，28.4%)、陰溝腸桿菌復合群(18株，18.9%)。95株CRE菌株對頭孢曲松、頭孢呋辛、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率≥90.5%，對阿米卡星的耐藥率≤26.3% ，對替加環素的耐藥率≤1.1%。陰溝腸桿菌復合群對亞胺培南、MEM、復方磺胺甲噁唑耐藥率均低于肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌，對阿米卡星、環丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率低于肺炎克雷伯菌(P<0.05)。由此可見，CRE對大多數抗菌藥物耐藥性較高，加大了臨床的治療難度。

CRE的主要耐藥機制是產碳青霉烯酶，因其編碼基因大都位于可轉移元件如質?；蜣D座子上，可在不同菌種菌屬間互相傳播。CLSI推薦mCIM試驗檢出產碳青霉烯酶菌株，eCIM試驗在mCIM結果陽性的前提下，結果陽性提示產金屬β-內酰胺酶，陰性提示產絲氨酸碳青霉烯酶(不能排除產金屬β-內酰胺酶，存在2種酶并存的可能)。由表3可知，95株CRE中，mCIM試驗陽性菌株93株(97.9%)，不產酶2株(2.1%)，而eCIM試驗陽性菌株49株(51.6%)，因此產絲氨酸酶44株(46.3%)，產金屬β-內酰胺酶49株(51.6%)。膠體金免疫層析法檢測93株產酶CRE菌株攜帶的碳青霉烯酶耐藥基因，44株絲氨酸酶菌株中檢出43株攜帶KPC耐藥基因，1株攜帶非KPC耐藥基因(試劑盒絲氨酸酶基因型僅有KPC)；49株產金屬β-內酰胺酶菌株全部檢出攜帶NDM耐藥基因；未檢出攜帶VIM、IMP、OXA-48、OXA-23耐藥基因的菌株。肺炎克雷伯菌CRE主要攜帶KPC型，占89.7%(35/39)，而大腸埃希菌CRE主要攜帶NDM型，占88.5%(23/26)，陰溝腸桿菌復合群也是攜帶NDM型為主，占88.2%(15/17)，構成比與王群等[8]報道類似，與高春海等[9]報道不同，可見不同醫院流行的CRE菌株構成比或占比均有差異。膠體金免疫層析法結果與mCIM、eCIM的檢測結果幾乎一致，且操作簡單，容易判讀，可以作為快速檢測碳青霉烯酶的一種新方法。

阿維巴坦是三乙烯二胺類酶抑制劑，能夠抑制包括碳青霉烯酶在內的A類、C類β-內酰胺酶，同時還對某些D類酶(OXA-10，OXA-48)具有抑制作用，但是對B類金屬β-內酰胺酶無效。CIA對于包括產KPC 酶在內的多重耐藥革蘭陰性桿菌均具有良好的抗菌活性，敏感率超過90%，是第一個可用于產KPC酶腸桿菌科細菌感染治療的新型β-內酰胺抗生素/β-內酰胺酶抑制劑復方制劑。本研究中，44株產絲氨酸酶菌株對CZA敏感率為97.7%，可見產絲氨酸酶菌株對CZA有較高敏感性；而49株產金屬β-內酰胺酶菌株對CZA全部耐藥，由此可見，檢測碳青霉烯酶型別顯得尤為重要。

因CRE菌對大多數藥物多重耐藥，臨床可使用的藥物有限，此次對主要CRE菌CZA和MEM、ATM進行聯合藥敏試驗，結果發現： 35株攜帶KPC基因的肺炎克雷伯菌有33株CZA和MEM、CZA和ATM有協同作用，未發現無關和拮抗作用，說明KPC基因型的肺炎克雷伯菌CZA聯合MEM、ATM產生了較好的體外抗菌活性；23株攜帶NDM基因大腸埃希菌中，有19株CZA和ATM有協同作用，說明對于攜帶NDM基因型的大腸埃希菌CZA聯合ATM產生了較好的體外抗菌活性。

綜上所述，佛山市中醫院CRE以肺炎克雷伯菌檢出率最高，主要以攜帶KPC基因型為主，其次是大腸埃希菌，以攜帶NDM基因型為主。CRE菌株對常用的多種抗菌藥物呈多重耐藥性，能使用的藥物十分有限。在極少抗菌藥物能應用時，可以通過檢測CZA和MEM、CZA和ATM是否協同作用來制訂抗感染策略。面對CRE目前世界性的流行和傳播，應根據當地CRE流行特點，對CRE進行早期基因型別檢測，盡可能控制CRE的感染和流行。同時，下一步準備深入研究CRE的耐藥機制，對于指導臨床合理用藥治療及研發新型抗菌藥物具有深遠意義。