肝細胞新生脂肪生成過程的全轉錄組表達譜分析*

張丹彤，逯素梅，高毅男，葉棣文,3，馬萬山△

1.山東第一醫科大學第一附屬醫院/山東省千佛山醫院檢驗科，山東濟南 250014；2.山東第一醫科大學/山東省醫學科學院，山東濟南 250117；3.濰坊醫學院醫學檢驗學院，山東濰坊 261053

肝臟作為人體最大的實體器官，在人體新陳代謝和解毒方面起著核心作用。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是我國最常見的慢性肝病，據調查10%～30%的NAFLD患者會發展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，當NAFLD進展為NASH時可快速進展為肝硬化，導致肝衰竭，增大肝細胞癌(HCC)的發病風險[1-2]。

NAFLD由包括肝臟脂肪堆積、線粒體功能障礙等在內的多種因素引起，發病機制復雜，會對患者生命健康造成威脅，增加社會醫療負擔。因此探索NAFLD發病機制尤為重要。人類基因組測序結果表明，人類基因組中93%的基因是轉錄的，其中包括編碼RNA(mRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)及環狀RNA(circRNA)等在內的大部分轉錄物為非編碼RNA(ncRNAs)。mRNA作為蛋白質合成的直接模板雖然只占細胞總RNA的2%～5%，但因其轉錄后修飾繁多而在疾病發病的研究中意義重大[3]。lncRNA表達水平的異常已被證實與人類肝臟疾病的發生、發展密切相關[4-5]。circRNA分子與線性RNA相比表達更加穩定，在哺乳動物中大量表達且穩定存在，且已有如circRNA_0001805、hsA_CIRC_0048179在內的多種circRNA被證明可能在脂肪變性的發病機制中發揮關鍵作用[6-7]。但目前有關NAFLD肝組織circRNAs表達譜的報道較少。

本研究采用人NAFLD細胞脂肪變性模型，利用真核生物全轉錄組測序技術，檢測mRNA、lncRNA、circRNA差異基因表達譜，為肝臟脂肪形成過程的基因調控機制提供理論指導。

1 資料與方法

1.1材料 人肝細胞株LO2(HL-7702)購于武漢普諾賽生命科技有限公司，以在體外培養的肝LO2細胞為研究對象，將其分為兩組，實驗組為50 μg/mL油酸誘導脂肪變性48 h，對照組加入等量二甲基亞砜(DMSO) ，與油酸同步作用。

1.2儀器與試劑 Trizol試驗(美國Invitrogen公司)；總RNA提取試劑(中國上海奕杉生物科技有限公司);Gibco胎牛血清(美國Thermo Fisher Scientific公司);RPMI-1640培養基(美國Thermo Fisher Scientific公司);磷酸緩沖鹽溶液(美國Thermo Fisher Scientific公司);0.25%胰蛋白酶-EDTA(美國Thermo Fisher Scientific公司);100×青霉素-鏈霉素雙抗懸液(中國北京索萊寶科技有限公司)，油酸(美國Sigma公司)；培養板(美國Corning公司)；油紅O粉末(美國Sigma公司)；異丙醇(上海國藥試劑有限公司)；去離子水(北京天根生化科技有限公司)；二氧化碳培養箱(中國上海力康生物醫療科技有限公司)；生物安全柜(中國濟南鑫貝西生物技術有限公司)；微量移液器(德國Eppendorf)；低溫高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司);Nanodrop 2000分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養與油酸誘導脂肪變性 將人肝細胞株LO2(HL-7702)培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，培養條件為37 ℃、5% CO2的培養箱，細胞密度達到80%左右時，加入0.25% 胰蛋白酶-EDTA進行消化離心，按照E6細胞數量接種于底面積75 cm2的培養皿中培養細胞，當細胞密度約至60%時，加入含有油酸(50 μg/mL)的RPMI-1640培養基，24 h更新一次培養基，油酸誘導脂肪變性48 h終止。對照組加入等量DMSO。將油酸誘導48 h的LO2脂肪變性細胞與對照組一起做油紅O染色，觀察脂質聚集情況；收集細胞于Trizol試劑中，用于RNA提取和測序文庫構建。

1.3.2RNA提取與質量檢測及真核生物全轉錄組測序 將收集于Trizol試劑中的細胞使用總RNA提取試劑提取總RNA，將總RNA溶于無酶無菌水，取2 μL溶液使用Nanodrop 2000分光光度計檢測RNA濃度與質量。將質量合格樣品送至上海康成生物科技有限公司進行真核生物全轉錄組測序。經過Nanodrop 2000濃度測定，每個樣品選取1～2 μgRNA進行RNA測序文庫的構建。構建好的文庫通過Agilent 2100 Bioanalyzer 鑒定文庫質量，并用qPCR方法進行文庫定量。混合好的不同樣品文庫使用Illumina X-ten/Novaseq測序儀進行測定。

1.4統計學處理 利用Solexa 1.8軟件進行圖像處理和堿基識別。采用FastQC軟件對去接頭后的reads進行測序質量評估(采用cutadapt去3′和5′接頭)。通過Hisat2軟件比對到參考基因組。使用StringTie軟件參考官方數據庫注釋信息進行轉錄豐度估計。使用R軟件Ballgown進行基因水平和轉錄物水平的FPKM計算，并分別計算基因水平和轉錄物水平表達差異情況，篩選出樣品間或組間差異表達基因。circRNA是通過STAR軟件比對到參考基因組，使用CIRCexplorer2進行Backsplice junction reads檢測，進行Reads count 統計，并使用R軟件 edgeR進行差異表達計算。基于基因表達水平進行PCA分析、相關性分析，對差異表達基因進行聚類、基因本體(GO)功能顯著性富集分析、Pathway 顯著性富集分析等。

2 結 果

2.1肝LO2細胞誘導脂肪變性的細胞模型 油酸誘導48 h的LO2實驗組與對照組做油紅O染色，可見實驗組與對照組相比細胞內有明顯的橘紅色脂滴聚集，見圖1A、1B，表明LO2細胞脂肪變性模型已建立。提取實驗組與對照組總RNA進行RNA電泳，檢測RNA完整性良好，見圖1C。Nanodrop 2 000進行RNA定量及質量檢測，見表1。

表1 RNA定量及質量檢測表

注：A為油紅O染色圖；B為紅油染色半定量圖；C為RNA電泳圖。圖1 油酸誘導LO2細胞脂肪變性以及RNA質量鑒定

2.2mRNA、lncRNA、circRNA在脂肪生成過程中的變化情況 將實驗組與對照組細胞進行真核生物全轉錄組測序。實驗組與對照組相比有564個circRNA發生了上調，有540個circRNA下調，1 005個circRNA沒有變化。實驗組與對照組相比有1 884個mRNA發生了上調，1 975個mRNA下調，29 045個mRNA沒有變化。實驗組與對照組相比有351個lncRNA發生了上調，有297個lncRNA下調，10 826個lncRNA沒有發生變化。

2.3聚類分析前10位上調及下調的mRNA、lncRNA、circRNA 針對差異表達的前10位上調及下調的mRNA、lncRNA、circRNA進行聚類分析，發現在實驗標本與對照標本的對比中，ANGPTL4、PDK4、CHAC1、TMEM199、UNC5B、DEFB1、TRIB3、AMIGO2、ORMDL3、GDF15的mRNA發生上調，ALPI、AC007240.1、ALPPL2、ALPP、MEOX1、RHAG、AC010422.6、HPD、NPY4R2、RARRES3的mRNA發生下調。H19、MEAF6、SLAIN2、GUK1、AGA、SEC14L1、CASP8AP2、ZBTB37、MAPKAP1、RALGPS2的lncRNA發生上調，LINC00511、AC093323.1、SNRPA1、CDSN、PNISR、NIT1、MOB3B、ENST00000628234、CRTC3、GRN的lncRNA發生下調。TM7SF3、RARS、PGD、PTPLA、FOXP1、PITPNC1、RHOBTB3、NUP214、RNF111、MAT2A的circRNA發生上調，PHC3、RABGAP1、ZNF420、SOX13、PUM1、C4orf47、FCHO2、TCONS_l2_00007569、CCZ1B、EIF4G3的circRNA發生下調。差異表達上調及下調前10位基因具體信息見表2～4。

表2 前10位差異表達的mRNA信息

表3 前10位差異表達的lncRNA信息

表4 前10位差異表達的circRNA信息

2.4對差異表達的mRNA進行GO功能富集分析生物學過程 上調差異基因主要富集到的生物學過程包括內質網應激反應、對肽類激素的反應、細胞對脂質的反應、對糖皮質激素刺激的反應、促腎上腺激素釋放激素刺激的反應、對有機氮化合物的反應、羧酸代謝過程、葡萄糖皮質激素的反應、對肽的反應、對脂質的反應，見圖2A。下調差異基因的生物學過程主要是對病毒的反應、免疫系統、對病毒的防御反應、對有機物質的反應、固有免疫應答、組織發育、免疫應答、對其他生物體的反應、對外界生物刺激的反應、對刺激的反應等功能有關，見圖2B。

注：A為上調差異基因的BP；B為下調差異基因的BP。圖2 肝LO2細胞誘導脂肪變性后差異表達mRNA的GO 分析

2.5對差異表達的mRNA進行Pathway富集分析 上調的mRNA差異基因的Pathway分析結果顯示，主要富集到的生物學過程包括脂肪酸降解、脂肪酸代謝、白細胞介素(IL)-17、沙門菌感染、PPAR、轉錄失調、代謝組學、軍團桿菌病、TNF、葉酸-碳。下調的差異mRNA的Pathway結果顯示，其中下調差異基因主要與維生素B1代謝、葉酸合成、蛋白質消化與吸收、補體和凝血、苯丙氨酸代謝、近端小管碳酸氫鹽回收、組氨酸代謝、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號轉導、RIG-Ⅰ樣受體信號通路、黏著斑等功能有關。

3 討 論

目前NAFLD發病率逐年升高，在男性中發病率為30%～40%，在女性中為15%～20%[8-10]，作為全球慢性肝臟疾病的主要病因，暫無藥物可以根治，臨床對于NAFLD患者的治療意見大多是減肥，但僅有少數患者可以通過減肥達到控制NAFLD的目的[11]。在亞洲，中國已成為NAFLD發病率最高的國家，其會給國家醫療系統帶來巨大的負擔[12]。因此探索NAFLD復雜的發病機制對于臨床治療NAFLD十分重要。

本研究成功建立了體外肝細胞脂肪變的模型，對肝細胞脂肪形成過程中全轉錄組表達譜的基本分析，分別給出了circRNA、lncRNA、mRNA在脂肪變模型中上調及下調基因的總體變化，以及circRNA、lncRNA、mRNA在脂肪變模型中顯著差異的基因信息。再充分運用生物信息工具挖掘NAFLD新生脂肪生成過程潛在的關鍵基因。通過GO分析得到上調的mRNA主要富集在脂肪酸代謝、脂肪酸降解及炎癥等信號通路；下調的mRNA主要富集在葉酸合成、蛋白質消化與吸收等信號通路。Pathway分析得到上調的mRNA主要富集在PPAR、組氨酸代謝、細胞對脂質及葡萄糖的反應等通路。Pathway分析得到下調的mRNA主要富集在免疫系統、免疫反應等通路。本研究結果所示關鍵差異基因有些在既往文獻中已顯示與NAFLD的發病及疾病進展有不同程度的相關性。其中與本研究一致的是Pathway分析mRNA得到的PPAR通路及上調前10位mRNA的血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)分子被驗證在NAFLD中PPAR-α/ANGPTL4信號通路在抑制NAFLD中發揮重要作用[13]。NAFLD發病的“二擊”理論廣為人知。第一擊，是由胰島素抵抗引起的肝細胞脂質的蓄積[14-16]。第二擊，是氧化應激引起的肝臟的損傷及炎癥，在活性氧的誘導下加劇肝細胞的損傷[17-18]。丙酮酸脫氫酶激酶同工酶4(PDK4)在調節葡萄糖攝取中起重要作用，與胰島素抵抗密切相關，因此會在NAFLD的發病中發揮重要作用[19]；另外有研究報道了TMEM199缺乏癥小鼠模型在飲食中出現了明顯的肝臟脂肪變性[20]。以上實驗結果都提示對于本研究預測到的一些有明顯變化的其他分子及信號通路對進一步進行NAFLD發病機制的研究有重要的意義。另外本研究揭示了重要的轉錄組成分mRNA發生高表達被顯著富集到的IL-17通路中的HSP90、TRAF6、USP25、轉錄因子等下游靶分子(通路)起到促進肝細胞脂肪變性及NAFLD向NASH進展的作用，為下一步動物實驗乃至靶向藥物研發提供了較為現實的理論依據。在下調的mRNA被富集到的蛋白質消化與吸收通路中，例如ASCT2、PAT1等分子，在后續研究中可能會成為研究NAFLD發病機制的重要分子，可從蛋白質組學層面進一步對NAFLD的研究提供新的思考。

綜上所述，本研究展示的在體外肝細胞新生脂肪形成模型中有顯著變化的共60個circRNA、lncRNA、mRNA。mRNA的Pathway及GO分析結果進一步豐富了基因的代謝網絡，在機制研究中尤為重要。本課題將為肝臟新生脂肪形成過程的基因調控機制提供理論指導，提示可以通過實驗進一步探索、挖掘NAFLD發病的具體機制。