MALDI-TOF-MS高靈敏度分析EGFR基因多位點突變方法的建立與應用*

黃海燕，孫 杰，徐煒新，王姜琳，孫亞蒙，汪國慶，葉紹云，蔣峻峰，聶芳芳,徐 軍，王 純△

1.上海健康醫學院附屬嘉定區中心醫院檢驗科，上海 201800；2.上海柏辰生物科技有限公司，上海 200233；3.新起點生物科技(蘇州)有限公司，江蘇蘇州 215123；4.上海健康醫學院附屬嘉定區中心醫院腫瘤內科，上海 201800

2018年全球新增肺癌病例達210萬，占癌癥總發病率的11.6%；新增肺癌死亡病例180萬，占癌癥病死率的18.4%，其中80%～85%為非小細胞肺癌(NSCLC)[1]。表皮生長因子受體(EGFR)基因突變是NSCLC中最常見的突變基因，亞洲人群NSCLC中的突變頻率高達40%～50%[2]。早期發現NSCLC患者 (ⅠA期)的5年生存率為73.0%，轉移晚期的生存率僅為3.7%[3]，由于發病的隱蔽性，75%的NSCLC患者就診時已處于晚期或已發生轉移，喪失了早期手術治療時機，整體NSCLC患者的5年生存率為15%～20%[3]。隨著分子生物學理論、檢測技術的發展和臨床數據的不斷積累，多個基因突變位點成為NSCLC患者個體化靶向治療和預后評價的標志物，對促使NSCLC患者及時、個體化治療，提高患者生存質量和生存率具有重要意義[4]。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)是20世紀發展起來的重要分析技術，其原理是激光照射分析物與基質形成的結晶后，生物大分子離子化，帶電生物大分子在電場作用下，在真空飛行管的飛行時間與分子量呈正比，以此來區分單個堿基的不同。鑒于其在已知突變基因分型方面的高特異性、高通量等特點，美國食品藥品監督管理局批準MALDI-TOF-MS用于臨床核酸檢測[5]。近期有研究顯示，5個肺癌相關基因的76種突變型檢測中，可檢測到的最高突變靈敏度達1%(5～10 ng)，使用國際通用標準品，能檢測到0.5%以上的突變標本(5 ng)[5]。低頻突變的多重檢測成為臨床診斷的必要工具，能夠有效支持針對血液循環腫瘤DNA(cfDNA)的伴隨診斷和對腫瘤的早期干預。本研究利用MALDI-TOF-MS建立EGFR基因E746_A750del、L858R、T790M位點突變的超高靈敏度檢測方法，并使用微滴式數字PCR(ddPCR)做驗證，比較2種檢測方法的一致性，探索MALDI-TOF-MS在臨床應用中的價值。

1 材料與方法

1.1材料 收集2019年1月至2021年12月來源于上海健康醫學院附屬嘉定區中心醫院檢驗科的228例NSCLC患者血液標本。病理診斷均為NSCLC，且研究過程中不對臨床實踐進行干預。標本收集已獲得患者知情同意。

1.2試劑 IPLEX Pro基因分型試劑購自美國Agena Bioscience公司(貨號10160)；ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)購自美國Bio-rad公司(貨號1863025)；Droplet Generation Oil for Probes購自美國Bio-rad公司(貨號1863005)；DG8TMCartridges and Gaskets購自美國Bio-rad公司(貨號1864007)；dPCR平臺EGFR基因T790M、L858R、E746_A750del突變位點分析試劑購自美國Bio-rad公司(貨號10031246、10031249)；人血液標本EGFR基因檢測試劑盒(上海源奇生物醫藥科技有限公司)；HiPure Circulating DNA Midi Kit 柱法游離DNA提取試劑盒購自上海邁跟生物科技有限公司(IVD3182-50C)；參考品EGFR Multiplex cfDNA Reference Standard Set購自英國Horizon公司(HD825)；引物和單堿基延伸引物及blocker探針由上海朗晶生物科技有限公司合成。

1.3方法

1.3.1標本收集及核酸提取 診斷為NSCLC的患者，在應用靶向治療藥物治療前抽取10 mL靜脈血標本，采集后2 h內進行離心分離血漿，1 600×g，4 ℃離心10 min，分離上層血漿后，16 000×g，4 ℃離心10 min，分離上層血漿5 mL并置于新的15 mL離心管中。血漿游離DNA(cfDNA)的提取使用HiPure Circulating DNA Midi Kit柱法游離DNA提取試劑盒抽提。

1.3.2ddPCR檢測 ddPCR的試劑配置：ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) 10 μL，EGFR基因T790M(L858R/E746_A750del位點)位點的野生型和突變型檢測試劑各1 μL，標準品定量實驗使用的模板總量7 ng，用無核酸酶水補充總反應體系為20 μL。將上述反應液加入DG8 cartridge微滴制備卡的第2排孔，最下排孔加入70 μL Droplet Generation Oil for Probes并蓋上膠墊，放入微滴制備儀中生成微滴，轉移至96孔板中進行PCR反應。PCR反應條件：95 ℃，10 min；94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，40個循環；98 ℃，10 min；4 ℃，保存。反應結束后，將96孔板放入QX200 Droplet readerTM(BIO-RAD) 中讀取微滴中的熒光信號，軟件Quantasoft Version 1.7.4.自動分析拷貝數結果。在臨床標本的檢測中，提取的患者cfDNA的上樣總量為8 μL，實驗過程與標準品定量的過程一致，將>2個陽性微滴數量設定為陽性標本判讀閾值[11]。

1.3.3MALDI-TOF-MS檢測 根據癌癥體細胞突變目錄號查詢3個突變位點的序列信息，分別為E746_A750del(COSM6223)、T790M(COSM6240)、L858R(COSM6224)。根據網站https://support.agenabio.com/設計檢測體系的引物，同時加入單堿基延伸引物和針對野生型模板的blocker(專利申請號：202111020697.5)。用上述突變型特異性擴增混合物擴增標本，PCR反應的組分見表1。PCR擴增條件為：95 ℃預變性2 min，(95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)45個循環，繼續72 ℃延伸5 min，最后4 ℃，保存。上述PCR產物20 μL，加蝦堿性磷酸酶(SAP，1.7 U/μL)1.2 μL、SAP緩沖液0.68 μL、無核酸酶水6.12 μL。合計28 μL混合液放入PCR儀中，反應條件：37 ℃，40 min；85 ℃，5 min，去除體系中的dNTP。下機后進行單堿基延伸反應，即在體系28 μL中，加入延伸酶Thermosequenase(33 U/μL)0.17 μL、延伸緩沖液0.8 μL、延伸Termination mix混合液0.8 μL，延伸引物混合液3.76 μL，加水補充到8 μL。單堿基延伸的反應條件：94 ℃ 30 s；[94 ℃ 5 s，(52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s) 5個循環]40個循環；72 ℃，3 min；4 ℃，保存。下機產物加水14 μL，將15 mg的潔凈樹脂平鋪在96孔dimple板上，風干10 min，標本與樹脂混合后，封口，在旋轉儀上顛倒混勻20 min，3 200×g離心5 min。將上述產物上清用MassARRAYTMRS 1000點樣儀點樣到配套芯片，MassARRAY分析儀進行芯片掃描，并用Typer 4.1進行分析。根據產物分子質量峰的位置判斷標本突變情況。

表1 MALDI-TOF-MS PCR反應的組分及濃度

1.4統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。用ddPCR檢測結果評估MALDI-TOF-MS檢測的靈敏度和特異度。采用Kappa一致性檢驗分析2種方法檢測結果的一致性。Kappa值：<0.40表示一致性較差，0.40～<0.75表示中度一致，≥0.75表示一致性較高。計數資料以例數或百分比表示，比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1本組研究對象的年齡和性別特征 本研究共納入研究對象228例，其中男138例(60.5%)，女90例(39.5%)；平均年齡(63.2±10.4)歲，中位年齡65歲，<65歲102例，≥65歲126例。觀察NSCLC患者性別在不同年齡段的影響，<65歲患者中男48例，女性54例，女性患者數量高于男性(P<0.05)；≥65歲患者中男90例，女36，男性患者數量高于女性(P<0.05)。

2.2ddPCR定量標準品線性 使用標準品HD825系列標準品做定量參考品，分別制作EGFR基因E746_A750del、L858R和T790M位點5%、1%、0.5%、0.1%和0%(野生型參考品)突變頻率的系列參考品，每個反應模板總量7 ng，用ddPCR(Bio-rad，QX200)檢測各梯度參考品的突變型和野生型拷貝數，各梯度參考品檢測野生型及突變型統計結果見表2，結果與預期一致。

表2 各位點不同突變比例的檢測結果統計

2.3各位點理論頻率與實際檢測頻率的線性回歸曲線圖 以理論突變頻率為橫坐標，以實際檢測突變頻率為縱坐標作圖，發現理論值與實際檢測值一致率很高(R2≥0.99)。見圖1。

注：A為E746_A750del位點的線性回歸曲線；B為L858R位點的線性回歸曲線；C為T790M位點的線性回歸曲線。圖1 各位點理論頻率與實際檢測頻率的線性回歸曲線圖

2.4MALDI-TOF-MS檢測各位點參考品靈敏度結果 使用MALDI-TOF-MS檢測不同位點參考品靈敏度，E746_A750del和T790M位點可檢測突變靈敏度達0.1%，可檢出最低突變拷貝數低至2.8拷貝/反應，L858R位點可檢測突變靈敏度達0.5%，可檢出最低突變拷貝/反應數為12拷貝/反應。見圖2。

注：A為E746_A750del位點突變2.8峰圖；B為L858R位點突變12峰圖；C為T790M位點突變2.8峰圖。圖2 MALDI-TOF-MS檢測各位點參考品靈敏度峰圖

2.52種方法檢測NSCLC患者血漿標本EGFR突變基因位點結果 分別用ddPCR平臺和MALDI-TOF-MS平臺檢測228例臨床標本的不同位點突變情況,與ddPCR檢測各位點突變相比，MALDI-TOF-MS檢測E746_A750del、L858R和T790M突變的一致率分別為98.7%、99.1%和98.2%。見表3。

表3 2種方法檢測NSCLC患者血漿標本EGFR突變基因位點結果[n(%)]

2.62種方法檢測突變情況比較 以ddPCR方法為金標準，MALDI-TOF-MS方法檢測突變與金標準的檢測突變情況結果見表4。

表4 2種方法檢測突變情況比較(n)

2.72種檢測3個突變位點的一致性比較 以ddPCR方法為金標準，MALDI-TOF-MS方法檢測突變的最低靈敏度為83.3%(T790M位點)，最低特異性為99.5%(E747_A750位點和T790M位點)，最低一致性Kappa值為0.87，與金標準的一致性較高(Kappa≥0.75)，見表5。

表5 2種檢測3個突變位點的一致性比較

3 討 論

肺癌早期患者能通過手術獲得組織標本進行病理和分子診斷，晚期患者難以通過穿刺、活檢等反復取樣來滿足輔助診斷和治療的需要，根據專家共識推薦，可使用外周血替代腫瘤組織作為檢測標本[6]。作為我國上市的第一款腫瘤靶向治療藥物，多項臨床試驗證實，EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)能使患者顯著獲益[7]。在NSCLC中，最常見的EGFR基因突變是第19外顯子的缺失突變和第21外顯子的L858R突變，約占EGFR基因突變的80%。有研究表明，與L858R突變患者相比，19外顯子缺失突變患者對EGFR-TKI更為敏感[7]。在EGFR-TKI治療后疾病進展期患者中，半數以上的患者出現對第一代、第二代EGFR-TKI耐藥的T790M位點突變，需進行第三代EGFR-TKI藥物治療[8]。鑒于對NSCLC患者治療和改善預后的重要性，2022年新版美國綜合癌癥網絡指南再次明確了基因檢測在伴隨診斷和輔助治療中的意義[9]。

目前，Super-ARMS QPCR、Roche Cobas EGFR V2檢測系統、高通量測序、高分辨率溶解曲線PCR、ddPCR等諸多平臺用于分析EGFR基因的突變檢測，ARMS方法可以檢測10 ng野生型背景下1%的突變頻率，是目前應用較為廣泛的方法，但由于ctDNA在血漿中含量低[10]，故本研究使用ddPCR作為標準品定量和臨床標本檢測的標準方法。在曹喆等[6]的研究中發現，ddPCR檢測血漿EGFR基因突變，無論在靈敏度還是在與組織標本一致性上，都優于Super-ARMS QPCR的方法，最高檢測靈敏度可達0.01%。MALDI-TOF-MS通過分析經激光解吸的不同短核酸鏈質量區分不同的基因型，具有分型結果準確、設計靈活和多個位點單孔檢測的特點，是研究EGFR基因突變的理想平臺[5]。

MALDI-TOF-MS平臺開發EGFR等多個基因突變檢測產品，其分析突變頻率靈敏度為1%(5～10 ng)[5]。RIVERO等[11]使用UltraSEEKTM方法在MALDI-TOF-MS平臺分析BRAF V600E突變，分析突變靈敏度可達0.1%，但在突變頻率低于0.2%時分析準確的降低。LAMY等[12]使用UltraSEEKTM和Cobas?panels分析115例EGFR組織突變標本，發現UltraSEEKTM在檢測19外顯子缺失和L858R時會漏檢更多，提示需要更高靈敏度的分析方法，以盡可能避免發生漏檢。本研究建立的MALDI-TOF-MS檢測EGFR基因3個位點突變方法，E746_A750del和T790M可檢測低至2.8拷貝的突變核酸分子，L858R位點可檢測低至12拷貝的突變核酸分子，突變頻率分別低至0.1%和0.5%，盡可能地減少了漏檢。

本研究中MALDI-TOF-MS檢測E746_A750del和L858R的突變患者比例為81.4%(70/86)，與其他研究基本吻合[13]。ddPCR檢測一個標本同時含有E746_A750del和L858R突變，而MALDI-TOF-MS只檢測到L858R突變，回溯ddPCR數據發現，該標本E746_A750del的突變頻率僅為0.05%。ddPCR檢測L858R和T790M雙突變標本6例，MALDI-TOF-MS檢測到其中4例，剩余2例因T790M頻率過低未檢測到質譜峰。ddPCR檢測E746_A750del和T790M雙突變標本6例，MALDI-TOF-MS檢測到其中5例，同樣因為T790M突變頻率過低而產生漏檢。ddPCR仍然在靈敏度方面存在優勢，但本研究中MALDI-TOF-MS的方法能夠實現多位點單孔檢測，使僅使用少量標本而完成多位點的高靈敏度分析成為現實，且不需要像UltraSEEKTM過程中用磁珠進行純化，簡化操作過程，節省檢測成本。

綜上所述，本研究建立了一種MALDI-TOF-MS平臺EGFR基因高靈敏度檢測方法，可僅用7 ng標本，一次性對EGFR基因的E746_A750del、L858R和T790M位點進行突變檢測，且與ddPCR檢測具有非常高的一致性，有助于高效篩選NSCLC的靶向治療方案，具有廣闊的臨床應用前景。