懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因克隆及其功能分析

夏瑾華， 李丹丹， 李 然， 劉賢泥， 劉子捷， 羅 冰， 歐麗佳

(1.上饒師范學院生命科學學院，江西上饒 334001； 2.上饒農業技術創新研究院，江西上饒 334001；3.上饒市藥食同源植物資源保護與利用重點實驗室，江西上饒 334001； 4.上饒市三葉青保育與利用技術創新中心，江西上饒 334001)

懷玉山三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg cv. Huaiyushan)，屬葡萄科崖爬藤屬植物，為我國特有珍稀藥用植物，也是江西省上饒市玉山縣特產和國家地理標志農產品，主要分布在以懷玉山山脈為中心的贛、浙、皖、閩相交的海拔800 m以上的高山山區[1]。南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室的鄧澤元教授、孫永教授及其團隊對懷玉山三葉青莖葉抗癌活性成分、塊根黃酮類成分及其藥理學作用進行研究，發現懷玉山三葉青莖葉抗癌活性成分有牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素和牡荊素等，塊根黃酮類成分有山奈酚蕓香糖苷、蘆丁、異槲皮苷、兒茶素、紫云英苷等[2]，這些化學成分不但能減慢癌細胞生長、抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡，還可作為癌癥預防治療的功能性食品[3-7]。此外，懷玉山三葉青具有較強的抗炎解熱活性[8]。2020年2月7日，上饒市衛健委印發《上饒市新型冠狀病毒感染的肺炎中醫藥防治方案(試行)》，其中懷玉山三葉青為新型冠狀病毒感染臨床治療期的推薦處方成分。患者在接受三葉青治療觀察后，發熱、咳嗽、乏力等呼吸道癥狀有明顯改善[9]。煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)屬帚狀病毒科(Vigaviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)病毒，可侵染 36 個科的 400 多種植物，每年給全世界農作物造成的經濟損失在1億美元以上[10]。目前有研究表明，煙草病毒復制蛋白2(tobamovirus multiplication protein 2，TOM2A)可以與來自西紅柿煙草花葉病毒(tomato mosaic virus，ToMV)感染原生質體的溶解膜130、180 ku的西紅柿花葉病毒復制蛋白(tomato mosaic virus replication proteins)共純化[11]；TOM2A主要定位于液泡膜上，130、180 ku的西紅柿花葉病毒復制蛋白和合成煙草病毒相關RNA的活性與液泡膜部分相關[12]；TOM2A在酵母中可以與煙草病毒復制蛋白1(tobamovirus multiplication protein 1，TOM1)相互作用，TOM2A對于膜上煙草花葉病毒(TMV)-Cg復制復合物的形成和/或維持起重要作用[13]。筆者所在課題組在對懷玉山三葉青2個栽培種的轉錄組分析中發現了TOM2A的亞型即TOM2A-like[8]。本研究將利用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術克隆懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like(tobamovirus multiplication protein 2A-like，TP2A-like)基因，并采用生物信息學方法、煙草轉基因技術和實時定量 PCR進行序列、功能和組織表達分析，為揭示懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like的生物學功能提供理論依據，為從分子水平調控懷玉山三葉青煙草花葉病毒增殖提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為懷玉山三葉青2個栽培種懷玉1號和懷玉2號的試管苗。試驗時間為2021年4—10月。試驗地點為上饒師范學院生命科學學院。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol 試劑提取懷玉山三葉青懷玉2號試管苗的總 RNA，提取步驟按說明書進行，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的濃度和完整性。以提取獲得的 RNA為模版，按照逆轉錄酶(M-MLV) cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成 cDNA 第一鏈。逆轉錄引物用 Oligo(dT) 18：5′-G G C C A C G C G T C G A C T A G T A C T T T T T T T T T T T T T T T T T T-3′，CDNA合成具體步驟按M-MuLV反轉錄酶說明書進行。

1.2.2 煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的克隆 利用轉錄組組裝的Unigene序列信息(TRINITY_DN36028_c0_g3)，運用 Primer Premier 5.0 設計引物(F：5′-A T G G C G T G C C G A G G T T G C-3′；R：5′-C A T G A T G G T G C A T C G G C T C C-3′)。PCR擴增條件：95 ℃ 預變性 2 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR 產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶與 pMD19-T 載體連接并用熱激法轉化到感受態細胞大揚桿菌(Escherichiacoli)DH5α，經鑒定正確的陽性轉化子提取質粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.3 煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的生物信息學分析 采用尹明華等的方法[14]對煙草病毒增殖蛋白2A-like基因進行生物信息學分析。

1.2.4 基因克隆和載體構建 以提供的目的基因序列設計引物(去掉終止密碼子TAG/TAA/TGA)[CZ-TP2A-like-BamHⅠ-GFPF：5′-A T G T C T A G A C T C G A GA T G G C G T G C C G A G G T T G C-3′；CZ-TP2A-like-BamHⅠ-GFPR：5′-G G C C G C T G T A C A C A TC A T G A T G G T G C A T C G G C T C C-3′(下劃線的堿基組成為載體同源重組序列)]進行PCR擴增。PCR反應體系(總體積50 μL)包括17 μL ddH2O、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix(10 mmol/L each)、2 μL模板DNA、2 μL引物1(10 μmol/L)、2 μL引物2(10 μmol/L)和1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease(1 U/μL)。PCR反應程序：95 ℃預變性 30 s；95 ℃變性15 s，59 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸1 min，39個循環；最后72 ℃延伸5 min。將PCR產物進行凝膠電泳。將條帶切膠回收，即為目的基因片段。用BamHⅠ酶切載體pCambia2301-KY-GFP線性化，回收后和目的基因片段重組反應。酶切反應體系包括2 μL 10×K /10×L Buffer、5 μL 載體質粒、2 μLBamHⅠ/KpnⅠ和ddH2O(補足至40 μL)。酶切產物純化后與上述PCR產物進行重組反應。重組連接反應體系(總體積10 μL)包括4 μL 線性化載體、1 μL 插入片段、2 μL 5×CE Ⅱ Buffer、1 μL Exnase Ⅱ和ddH2O(補足至10 μL)。重組產物轉化大腸桿菌DH5α細胞。挑取PCR陽性的轉化子搖菌培養提取質粒，同時對擴增產物進行測序。擴增和測序引物為插入目的基因兩側的載體序列，分別為35S-F：5′-G A C G C A C A A T C C C A C T A T C C-3′；GFP-JR：5′-G G G T G A G C T T G C C G T A G G T G G-3′。

1.2.5 煙草葉片亞細胞定位 采用尹明華等的方法[14]對煙草病毒增殖蛋白2A-like基因進行煙草葉片亞細胞定位。

1.2.6 煙草病毒增殖蛋白2A-like轉基因株系PCR檢測 煙草葉片用農桿菌侵染后均經過4次篩選/繼代，誘導出抗性芽，再轉入伸長培養基中。采用PCR對其再生苗進行鑒定，得到煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的煙草轉基因株系。引物F： 5′-A T G G C G G C G T G C C G G G G W T-3′；R：5′-C A T T A C G R T G C A A C G G C T C C-3′。2×TaqMaster Mix擴增體系(共20 μL)包括7 μL ddH2O、10 μL 2×TaqMaster Mix、1 μL 模板DNA、1 μL引物1(10 μmol/L)、1 μL引物2 (10 μmol/L)。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s ，72 ℃延伸 60 sec/kb，35個循環；72 ℃徹底延伸5 min。

1.2.7 煙草病毒增殖蛋白2A-like轉基因株系和非轉基因株系移栽苗的病毒接種和光合指標檢測 采用尹明華等的方法[14]對煙草病毒增殖蛋白2A-like轉基因株系和非轉基因株系移栽苗的病毒接種和光合指標進行檢測。

1.2.8 煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的組織表達分析 分別取懷玉山三葉青2個栽培種懷玉1號和懷玉2號試管苗的根、莖、葉RNA各500 ng，反轉錄為cDNA。熒光定量 PCR(qRT-PCR，SYBR GreenⅠ)檢測內參基因為GAPDH。設計引物為R：5′-G C T T T G G G C A G T T T A T C C-3′；F：5′-T T C C A G C G A A A C C C T T A C-3′。qRT-PCR 檢測采用 20 μL 反應體系，PCR反應程序： 95 ℃預變性10 min；95 ℃ 變性10 s，52 ℃ 退火34 s， 95 ℃延伸15 s，40個循環。使用 2-ΔΔCT法計算基因表達水平。試驗重復3次。所有數據表示為平均值±標準差，并使用SPSS 19.0軟件進行統計分析，應用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗煙草病毒增殖蛋白 2A-like基因組織表達的差異顯著性(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA序列、氨基酸序列和親疏水性分析

通過PCR擴增，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA總長度為828 bp(圖1)，G+C 含量為46.50%(圖2)。

ProtParam預測的懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like氨基酸序列見圖3。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like由275個氨基酸組成，分子量為30 728.97 u，等電點為5.39，為疏水性蛋白。

各氨基酸的數量和比例詳見表1。帶負電殘基的氨基酸(Asp+Glu)總數為28個，帶正電荷殘基(Arg+Lys)總數為26個。序列的N端和C端均為M(Met)。失穩指數(II)計算為47.71，說明該蛋白質為不穩定蛋白質。

表1 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like氨基酸的數量和比例

由圖4可知，高峰值(正值)的區域表示疏水的區域，而負值的低谷區域是親水區域。疏水性分析結果表明，最大疏水值為4.0左右，在該多肽中說明該處的疏水性最強；親水峰最大值為-2.5左右，整個蛋白質表現出高度的疏水性，說明該蛋白為疏水性蛋白質。

2.2 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like二級結構和三級結構分析

李小樹發火了，我第一次見到李小樹對大黑貓發那么大的火，他氣急敗壞地提著大黑貓的后頸窩一把把它扔出了窗外。大黑貓被扔出去后又撕心裂肺地叫著從窗口爬了進來，李小樹仍沒解氣，他從雜屋間找來一個廢舊的紙箱，三下兩下就把大黑貓裝進了紙箱里，然后把它送給了我。

懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like的二級結構(圖5)預測如下：GOR預測顯示其二級結構由α螺旋(Hh，28.36%)、β-片層(Ee，20.73%)、無規則卷曲(Cc，50.91%)構成。從分布位點上來看，C端和N端含無規則卷曲、β-片層和α-螺旋，且無規則卷曲、β-片層和α-螺旋散布于整個蛋白質中。SWISS-MODEL預測結果顯示，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like的三級結構為單體跨膜蛋白(圖6)。

2.3 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like亞細胞定位預測

采用 WoLFPsort在線軟件對懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的表達部位進行預測，結果(圖7)表明，定位于液泡膜中的數量為9，質膜中的數量為2，胞外的數量為1，內質網中的數量為1，高爾基體中的數量為1。表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因主要存在液泡膜中。

2.4 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like系統進化分析及其同源蛋白的序列比對

從構建的進化樹(圖8)中可見，懷玉山三葉青與葡萄(Vitisriparia)在一個大分支中，這說明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like在進化上與葡萄tobamovirus multiplication protein 2A(GenBank： XP_034708140.1、XP_002279170.2)的同源性最高，同源性達到86.79%。

懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like同源蛋白的序列比對信息見圖9，*號區域是煙草病毒增殖蛋白家族的保守結構域。

以提供的目的基因序列設計引物(去掉終止密碼子TAG/TAA/TGA)進行PCR擴增。將PCR產物進行凝膠電泳。結果顯示：在目標位置擴增到單一條帶，大小正確。將條帶切膠回收，即為目的基因片段(圖10)。用BamHⅠ/KpnⅡ酶切載體pCambia2301-KY-GFP線性化，回收后和目的基因片段重組反應。重組產物轉化大腸桿菌DH5α細胞。挑取PCR陽性的轉化子搖菌培養提取質粒，對重組質粒進行酶切檢測，同時對擴增產物進行測序。測序比對結果顯示：目的基因已插入載體，表達載體構建準確(圖11)。

2.6 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like亞細胞定位分析

通過煙草葉片瞬時表達，將煙草病毒增殖蛋白2A-like融合綠色熒光蛋白(GFP)的載體質粒2301-TP2A-GFP轉入農桿菌，吸取農桿菌液，壓迫注入煙草葉片下表皮(背面)進行煙草病毒增殖蛋白2A-like亞細胞定位分析(圖12)。利用激光共聚焦顯微鏡觀察，融合GFP的煙草病毒增殖蛋白2A-like轉化煙草葉片只在細胞質和細胞核觀察到綠色熒光，表明煙草病毒增殖蛋白2A-like定位于細胞質和細胞核，與 WoLFPsort在線軟件預測結果一致。

2.7 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉基因煙草鑒定和光合特征

經PCR檢測，獲得懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉基因陽性煙草和轉基因陰性煙草(圖13)。光合生理的測定結果表明：與懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉基因陰性煙草相比較，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉基因陽性煙草的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、最大光化學效率(Fv/Fm)、實際光化學量子效率(ΦPSⅡ)、光化學淬滅系數(qP)及電子傳遞效率(ETR)顯著下降，而非光化學淬滅系數(NPQ)顯著上升(表2)。

表2 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉基因陽性植株和轉基因陰性植株的光合參數和葉綠素熒光參數比較

2.8 懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的表達分析

以懷玉山三葉青的GAPDH為內參基因，利用實時熒光定量PCR分析懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因在懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中的表達情況，結果顯示，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因在懷玉2號和懷玉1號2個栽培種的根、莖、葉中均有表達，其中在根和莖中的表達差異不顯著，而在葉中的表達量顯著增高(圖14)。

3 討論與結論

Hagiwara等的研究表明，TOM2A主要定位于液泡膜上，花葉病毒復制蛋白和合成煙草病毒相關RNA的活性與液泡膜部分相關[12]。在本試驗中，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA總長度為828 bp，G+C含量為46.50%；懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like由275個氨基酸組成，分子量為30 728.97 u，等電點為5.39，為疏水性蛋白；二級結構由α-螺旋(28.36%)、β-片層(20.73%)、無規則卷曲(50.91%) 構成；三級結構為單體跨膜蛋白；軟件預測懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like亞細胞定位于液泡膜，但通過煙草葉片亞細胞定位分析發現，煙草病毒增殖蛋白2A-like定位于細胞質和細胞核中。說明煙草病毒增殖蛋白2A-like與TOM2A的亞細胞定位不同。從堿基組成和G+C含量基本平衡來看，G+C的含量越高，基因穩定性越高，三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因基本處于穩定狀態，這可能為三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因穩定遺傳與進化提供了保證。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白 2A-like 與葡萄煙草病毒增殖蛋白2A(GenBank：XP_034708140.1、XP_002279170.2)的同源性最高，同源性達到86.79%，說明三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因具有保守性。這些保守區段的發現將為其他物種新的三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的克隆提供序列依據。還有研究表明，擬南芥TOM1和TOM2A是煙草病毒細胞內高效增殖所必需的完整膜蛋白[12]。

懷玉山三葉青繁殖主要靠無性繁殖，由于這一繁殖特點，受到病毒侵染后，會世代傳染[1]。懷玉山三葉青一旦感染煙草花葉病毒后，會導致種性退化，產量下降，品質變劣[1]。有研究表明，枸杞感染病毒后葉綠素含量顯著下降，光合強度顯著降低[15]；甘薯感染甘薯羽狀斑駁病毒和甘薯潛隱病毒后，蔓長短，分枝少，葉片數不多，SPAD 值低，光合效應下降[16]。在本試驗中，與懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉基因陰性煙草相比較，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉基因陽性煙草的光合參數(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、最大光化學效率(Fv/Fm)、實際光化學量子效率(ΦPSⅡ)、光化學淬滅系數(qP)及電子傳遞效率(ETR)顯著下降，而非光化學淬滅系數(NPQ)顯著上升，表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因通過煙草花葉病毒增殖繼而影響煙草的光合作用。這與上述他人的研究結果一致。

研究表明，基因的組織表達特征與其功能緊密相關[16-17]。在本試驗中，實時定量PCR結果顯示，懷玉山三葉青懷玉2號和懷玉1號煙草病毒增殖蛋白2A-like基因均在葉中表達量最高，表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因在葉片的煙草病毒增殖過程中起著重要的調控作用。