冀紫439黑小麥與濟麥22普麥蛋白及加工品質的比較

王瀅穎，王晗，李慧靜

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

冀紫439黑小麥是由澳大利亞黑小麥與我國白粒小麥雜交的一種人工谷物，因其富含非淀粉多糖、花色苷、硒元素、鉻元素、多酚類物質，蛋白質、氨基酸含量高，受到研究者及消費者的廣泛關注[1]。濟麥22小麥是由山東省農業科學院作物研究所研發的高產抗病的小麥品種，種植廣泛，加工品質較好[2]。不同品種黑小麥粉穩定時間在2.8 min左右[3-5]，濟麥22小麥粉穩定時間在2.7 min左右[2]，Fra等[6]研究發現黑小麥雖然蛋白質含量高，但難以發酵和烘焙，制作的面包最大體積為439 cm3，仍低于普通小麥粉制作的面包的體積（473 cm3），僅通過黑小麥蛋白質含量無法預測黑小麥的加工品質和面包的制作質量，這大大限制了黑小麥食品的研發與生產。

蛋白質在小麥粉加工中發揮關鍵作用，根據Osborne分類系統，小麥粉中的蛋白質主要分為清蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀鹽溶液）、醇溶蛋白（溶于70%乙醇）、谷蛋白（溶于稀堿溶液）。清蛋白與球蛋白為小麥可溶性蛋白，清蛋白中賴氨酸含量高、氨基酸組成平衡，對小麥粉營養品質有重要影響，面包體積與清蛋白含量呈負相關，與球蛋白含量呈正相關，可溶性蛋白對小麥粉加工品質也有一定影響[7-8]。醇溶蛋白與谷蛋白為小麥貯藏蛋白，是面筋蛋白的主要組成部分，小麥粉與水作用時，氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵等分子間作用力促使面筋蛋白形成片狀的網絡結構來保留面團內部氣體，醇溶蛋白主要與面團的黏性及延展性有關，谷蛋白與面團的彈性有關[7，9]。目前，關于黑小麥蛋白特性的研究主要集中在醇溶蛋白亞基及高分子量谷蛋白亞基上，關于蛋白組分及內部化學作用的研究較少[3，10-11]，所以更深層次了解黑小麥蛋白特性對優化黑小麥加工品質有重要作用。

本文選取與冀紫439黑小麥粉質參數相似的濟麥22普通小麥作對照，提取面筋蛋白及Osborne分離蛋白組分，分析蛋白內部化學作用對面團結構、黏彈性及饅頭的影響，以期為黑小麥后期加工品質提升提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濟麥22小麥：河北省現代農業產業技術體系衡水試驗站；冀紫439黑小麥：館陶縣華野莊園；酵母：安琪酵母股份有限公司；電泳標準品：美國伯樂公司；2-β巰基乙醇、過硫酸銨：北京博奧拓達科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷[tris-（hydroxymethyl）-aminomethane，Tris]、甘氨酸（Gly）、5，5'-二硫雙（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、考馬斯亮藍R-250、G-250：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LMB實驗磨粉機：布勒糧食檢驗儀器無錫有限公司；752N型分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；Mixer S 300N粉質儀、Extensograph-E拉伸儀：德國Brabender公司；JJJM54型面筋數量和質量測定儀：杭州匯爾儀器設備有限公司；DYCZ-28A型單板夾芯式垂直電泳儀：北京六一儀器廠；Nicolet IS10紅外光譜儀：美國尼高力公司；SU8020型掃描電子顯微鏡：日立科學儀器有限公司；TMS-PRO質構儀：美國FTC公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥粉的制備

小麥粉由磨粉機磨制而成，將小麥潤麥至水分含量為14%左右，出粉率在60%左右。所得小麥粉的粗蛋白含量分別為13.54%（濟麥22）和14.83%（冀紫439）。

1.3.2 小麥粉蛋白組分分析

1.3.2.1 清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的提取

稱取一定量的小麥粉，按照料液比1∶5（g/mL）加入石油醚，磁力攪拌脫脂4 h，將脫脂好的小麥粉抽濾，室溫下放置至石油醚完全揮發。利用Osborne法分離提取4種蛋白質[12]，稱取50 g小麥粉依次用10倍的去離子水、2 g/100 mL NaCl溶液、70%乙醇、0.01 mol/L NaOH溶液50℃下磁力攪拌1.5 h，4 000 r/min下離心20min，上清液分別為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白溶液，利用考馬斯亮藍法準確測定溶液內蛋白質含量。

1.3.2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

電泳采用分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%的凝膠[13]，使用2倍樣品稀釋液[10%0.5 mol/L Tris-HCl pH6.8，10%甘油，20 g/100 mL SDS，0.1 g/100 mL 溴酚藍，5%2-β-巰基乙醇]溶解樣品，泳道進樣量約為10 μg，初始電壓為80 V，待樣品進入分離膠后，電壓改為160 V，電泳完畢后取下凝膠置于固定液（50%乙醇，10%冰乙酸）中，2 h后取出凝膠置于0.25 g/100 mL考馬斯亮藍R-250染色液染色2 h后脫色，直到蛋白質條帶清晰，采用Quantity One 4.6.2軟件對亞基分子量進行分析。

1.3.3 面筋蛋白的提取及分析

面筋蛋白的提取采用手洗法，根據馬福敏[14]的方法并稍加修改，取50 g小麥粉，加26 mL 2 g/100 mL NaCl溶液揉成面團，用蒸餾水不斷揉洗直至用碘試劑檢測不變藍，揉洗后，將乳狀液過100目篩，面片及小面團沖洗后加入面筋中。將洗好的面筋蛋白凍干，磨制成粉末備用。

1.3.3.1 面筋蛋白二級結構的測定

稱取一定量的蛋白質樣品與溴化鉀混合（質量比1∶100），用研缽磨制成均勻粉末，壓制成薄片，然后于紅外光譜儀中進行全波長（400 cm-1～4 000 cm-1）掃描，光譜儀分辨率4 cm-1，信噪比50 000∶1，掃描64次。利用OMNIC截取酰胺Ⅰ帶區域（1 600 cm-1～1 700 cm-1）圖譜，利用PeakFit v4.12軟件對此區域先基線校正，Gaussian去卷積，再由二階導數擬合，確定各個子峰與各二級結構的對應關系，然后根據各子峰所占面積計算出各部分二級結構所占的比例[15]。

1.3.3.2 面筋蛋白分子間作用力的測定

參照Wang等[16]的方法并稍作修改，稱取4組0.09g面筋蛋白樣品，分別加入1.5 mL 0.05 mol/L NaCl溶液（SA）、0.6 mol/L NaCl溶液（SB）、0.6 mol/L NaCl溶液+1.5 mol/L尿素溶液（SC）、0.6 mol/L NaCl溶液+8 mol/L尿素溶液（SD），混合并振蕩5 min，室溫下振蕩1 h，在12 000 r/min下離心20 min，取上清液用考馬斯亮藍法測定上清液蛋白質含量，SB與SA中蛋白質含量之差為離子鍵的貢獻，SC與SB中蛋白質含量之差為氫鍵的貢獻，SD與SC中蛋白質含量之差為疏水相互作用的貢獻。

1.3.3.3 巰基和二硫鍵的測定

1）游離巰基的測定

稱取100mg面筋蛋白，加入10mLTris-Gly-8mol/L尿素溶液和50μLDTNB溶液，迅速混合后在25℃下避光保溫30 min，樣品取出在4 000 r/min下離心10 min，取上清液，利用分光光度計測定其在412 nm下的吸光度，同時測定空白值[17]。

2）總巰基的測定

稱取10 mg面筋蛋白，加入1 mL Tris-Gly-10 mol/L尿素溶液和0.02 mL β-巰基乙醇迅速混合后在25℃下保溫1 h，再加10 mL 12%的三氯乙酸，繼續保溫1 h，樣品取出在4 000 r/min下離心10 min，沉淀用10 mL 12%三氯乙酸洗滌并離心，重復2次。棄去上清液，在沉淀中加入3 mL Tris-Gly-8 mol/L尿素溶液和0.03 mL DTNB溶液，迅速混合后在25℃下避光保溫30 min，取上清液測其在412 nm下吸光度，同時測定空白值[17]。

式中：SHfree為游離巰基含量，μmol/g；SHT為總巰基含量，μmol/g；S-S 為二硫鍵含量，μmol/g；73.53=106/（1.36×104），1.36×104是 Ellman 試劑的摩爾消光系數；A412為λ=412 nm下的吸光度；D為稀釋倍數；C為樣品的蛋白質最終濃度，mg/mL。

1.3.4 面筋及流變學指標的測定

濕面筋含量及面筋指數根據GB/T 5506.2—2008《小麥和小麥粉面筋含量第2部分：儀器法測定濕面筋》、LS/T 6102—1995《小麥粉濕面筋質量測定法——面筋指數法》測定，粉質特性參照GB/T 14614—2019《糧油檢驗小麥粉面團流變學特性測試粉質儀法》的方法測定，拉伸特性參照GB/T 14615—2019《糧油檢驗小麥粉面團流變學特性測試拉伸儀法》的方法測定。

1.3.5 面團微結構的觀測

將樣品固定于樣品臺，采用戊二醛將樣品固定，離子濺射儀真空干燥、鉑金噴鍍，電鏡的工作電壓設置為5 kV，最后置于掃描電子顯微鏡上拍攝圖片，設置不同拍攝倍數，多角度拍攝。

1.3.6 饅頭質量評估

參照GB/T 35991—2018《糧油檢驗小麥粉饅頭加工品質評價》制作饅頭，制作好的饅頭蓋上紗布放置1 h后，測定其徑高比、比容及質構特性。

參照Sun等[18]的方法進行質構特性的測定，饅頭切成20 mm的薄片，形變量為50%，檢測速度為60 mm/min，啟始力為5N，重復測試，選取5組取平均值。

1.4 數據處理與統計分析

數據統計采用Excel 2010軟件，采用SPSS 25.0軟件進行ANOVA差異性分析，用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 蛋白組分含量分析

濟麥22和冀紫439小麥粉各蛋白組分含量分析結果見圖1。

圖1 各蛋白組分含量分析Fig.1 Content of various proteins

由圖1可知，兩種小麥粉中水不溶性蛋白（醇溶蛋白及谷蛋白）的總量要比水溶性蛋白總量多。由4種蛋白含量排序可知，小麥粉中谷蛋白含量最高，與Dupont等[19]的研究結果一致。冀紫439小麥粉與濟麥22小麥粉相比，冀紫439小麥粉在清蛋白、谷蛋白含量上顯著高于濟麥22，醇溶蛋白含量無顯著差別，球蛋白含量顯著降低。冀紫439中谷蛋白∶醇溶蛋白比例為2.33∶1，濟麥22中谷蛋白∶醇溶蛋白比例為1.98∶1，谷蛋白含量增多導致冀紫439谷蛋白與醇溶蛋白比例顯著高于濟麥22。水溶性蛋白中，清蛋白含量增高易對成品品質產生不利影響[8]。面筋蛋白中，谷蛋白對面團強度及面團組分影響作用強，谷蛋白含量增多在一定程度上對面團彈性及流變學特性產生有利的影響。Zhang等[20]研究發現，醇溶蛋白含量與普通小麥所制北方饅頭評分呈負相關，谷蛋白含量饅頭評分呈正相關，谷蛋白與醇溶蛋白比例與饅頭的感官評分顯著相關。但徐小青[21]研究發現，谷蛋白與醇溶蛋白比例過大也會對小麥粉加工品質產生不利的影響。由此看來，黑小麥蛋白組分是影響黑小麥加工品質的一個重要因素。

2.2 蛋白亞基分析

小麥粉及其蛋白組分SDS-PAGE圖見圖2。

圖2 小麥粉及其蛋白組分SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of wheat flour and the protein constituents

由圖2可知，由于基因型的差別，冀紫439與濟麥22蛋白條帶差別較大，具體分子量的差異表現：在75 kDa～100 kDa，濟麥 22 第三條亞基為 81 kDa，冀紫439缺少這一條帶；在50 kDa～75 kDa，冀紫439比濟麥22多1條亞基，為69 kDa；為更深入對比研究黑小麥與白粒小麥蛋白組分，對兩種小麥4種蛋白組分同時進行SDS-PAGE分析。結果表明，濟麥22與冀紫439清蛋白亞基分布有很大差異，具體表現為濟麥22的45、31 kDa兩條亞基，冀紫439的35 kDa亞基。球蛋白亞基分布類似。醇溶蛋白亞基主要分為α/β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白，α/β 醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白亞基分布于28 kDa～35 kDa，ω醇溶蛋白亞基分布于40 kDa～75 kDa[22]。冀紫439檢測到高分子量黑小麥醇溶蛋白，黑小麥醇溶蛋白包括高分子量黑小麥醇溶蛋白、γ-75k黑小麥醇溶蛋白、ω-醇溶蛋白、γ-40k黑小麥醇溶蛋白，高分子量黑小麥醇溶蛋白對面團的黏彈性產生負面的影響[10]，黑小麥中高分子量黑小麥醇溶蛋白遺傳自黑麥基因，與其谷蛋白有相同的遷移率[3]。谷蛋白分為高分子量谷蛋白亞基及低分子量谷蛋白亞基，高分子量亞基谷蛋白分布于65kDa～90kDa，低分子量亞基谷蛋白分布于30kDa～45kDa[22]。由圖2可看出，谷蛋白分子量較高，二硫鍵還原后，主要亞基為低分子量谷蛋白亞基，高分子量谷蛋白亞基屬于次要亞基。濟麥22小麥粉與冀紫439小麥粉相比，冀紫439缺少89 kDa高分子量谷蛋白亞基和28 kDa低分子量谷蛋白亞基條帶。部分低分子量谷蛋白亞基和高分子量谷蛋白亞基通過鏈間二硫鍵連接，高分子量谷蛋白亞基形成一個彈性網絡，作為與其它蛋白相互作用的骨架[23]，黑小麥與普通小麥亞基的差異，尤其是高分子量谷蛋白亞基的差異或可造成兩種小麥粉加工品質的差異。

2.3 面筋蛋白分析

2.3.1 化學相互作用分析

面筋蛋白間化學相互作用分析結果見圖3。

圖3 面筋蛋白間化學相互作用分析Fig.3 Chemical interaction of gluten proteins

影響蛋白質結構和性質的主要有離子鍵、氫鍵、疏水相互作用及二硫鍵。通過鹽離子將2種小麥粉的離子鍵打破，分析得濟麥22與冀紫439相比，冀紫439中離子鍵含量顯著增高，氫鍵含量顯著降低，疏水相互作用差異不顯著。離子鍵含量均小于1 mg/mL，在面團中作用微弱，氫鍵是蛋白質鏈內或鏈間的作用力之一，與水與其他物質之間的作用有關，面團中糖類及極性脂均能影響氫鍵含量，疏水相互作用主要影響蛋白質分子中的亞基的連接，使蛋白質在極性強的水中聚集折疊到一起，使蛋白質內部更加穩定[24-25]，氫鍵的減少不利于冀紫439面筋蛋白網絡結構的穩定。

二硫鍵屬于共價鍵的一種，在肽鏈內可以起到連接氨基酸的作用，同時在鏈間也起著連接不同肽鏈的作用，二硫鍵的存在對穩定面筋網絡起著重要作用[26]。對兩種小麥粉進行比較，濟麥22的總巰基含量及二硫鍵含量均高于冀麥439黑小麥，二硫鍵的增加在一定程度上能賦予濟麥22面團更好的網絡結構。

2.3.2 二級結構分析

面筋蛋白二級結構占比分析結果見圖4。

圖4 面筋蛋白二級結構占比分析Fig.4 Proportions of secondary structure elements of gluten proteins

紅外光譜中酰胺Ⅰ帶（1 600 cm-1～1 700 cm-1）主要與蛋白質的二級結構有關。每個子峰與二級結構的對應關系：1 648 cm-1～1 664 cm-1為 α-螺旋，1 615 cm-1～1 637cm-1和 1682cm-1～1700cm-1為 β-折疊，1664cm-1～1 681 cm-1為 β-轉角，1 637 cm-1～1 648 cm-1為無規卷曲[15]。冀紫439與濟麥22相比，α-螺旋、β-轉角增加，β-折疊減少。β-折疊結構對面筋蛋白網絡結構的穩定性有重要的影響，面筋蛋白聚合物通過分子間二硫鍵和β-折疊保持穩定[27]。Li等[28]研究發現β-折疊結構向α-螺旋、β-轉角結構轉化很可能是因為氫鍵的變化導致蛋白質水合作用增大，蛋白質-蛋白質間的相互作用減弱，不利于面筋蛋白網絡結構的穩定。因此，黑小麥面筋蛋白的理化特性與其二級結構和氫鍵等化學相互作用密切相關。

2.4 小麥粉面筋指標與流變學指標分析

小麥粉面筋指標與流變學指標分析結果見表1和表2。

表1 面筋及粉質特性分析Table 1 Gluten and farinograph properties

表2 拉伸特性Table 2 Extensograph properties

由表1可知，冀紫439與濟麥22相比，面筋指數與濕面筋含量顯著升高，面筋指數與谷蛋白含量呈正相關[29]，根據GB/T 17320—2013《小麥品種品質分類》對小麥粉根據穩定時間分類，濟麥22和冀紫439小麥粉穩定時間均＜3 min，同屬于弱筋小麥粉，與Pattison等[3]測定的黑小麥的穩定時間（＜2.7 min）相似。雖然粉質指標差異不大，但蛋白質含量相差1.29%，冀紫439小麥粉蛋白質含量較高，濕面筋含量、面筋指數較高。由表2可知，醒發時間為45 min和90 min時，冀紫439拉伸面積、拉伸阻力、拉伸比例顯著高于濟麥22，但延伸度略低于濟麥22，徐小青[21]研究指出麥谷蛋白∶麥醇溶蛋白比例增加會造成面團強度及耐攪拌特性增大，但延伸度降低，Zhu等[30]研究得出蛋白質含量增加在一定程度上會造成延伸度減小，饅頭比容減小，這與黑小麥谷蛋白∶醇溶蛋白比例高，蛋白質含量高研究結果一致。

2.5 面團微結構

面團微結構見圖5。

圖5 面團掃描電子顯微鏡圖Fig.5 Scanning electron micrograph of dough

由圖5可知，濟麥22與冀紫439小麥粉相比，冀紫439小麥粉結構更加致密，可延展的面筋蛋白覆蓋了所有的淀粉顆粒，無明顯的孔洞。濟麥22小麥粉制成的面團結構疏松，大量淀粉暴露在面筋蛋白表面，兩者面團結構有較大差異，這可能是對其面制品品質造成影響的重要原因，還需進一步分析。

2.6 饅頭品質

饅頭感官品質及質構特性見表3。

表3 饅頭感官品質及質構特性Table 3 Sensory quality and texture properties of steamed bread

從表3中可以看出，冀紫439黑小麥所制饅頭寬高比為滿分，比容接近滿分，適合加工成饅頭。從質構特性分析，黑小麥饅頭的硬度、咀嚼性、彈性更大，濟麥22的饅頭回復性大。在對黑小麥發酵制品研究中，劉瑞等[31]將運黑161黑小麥和運旱618白粒小麥饅頭進行對比發現，運黑161黑小麥的饅頭硬度是運旱618普通小麥的2倍，咀嚼性是其4.6倍。黑小麥饅頭普遍存在嚼勁大的特點。這可能是因為在發酵過程中，隨時間的延長，黑小麥面團的延展性降低，最終導致面團氣孔較小且緊密，饅頭的內部結構相較于普通小麥也更加緊實。同時，較高的谷蛋白含量也會賦予面團更高的咀嚼性及抗撕裂性[32]，造成黑小麥饅頭咀嚼性顯著高于普通小麥饅頭。

3 結論

本試驗通過比較冀紫439黑小麥與濟麥22普通小麥的蛋白組分及亞基、面筋蛋白的二級結構及分子間作用力來探討粉質參數相似下黑小麥與普通小麥面筋質量及饅頭的差異。從結果分析黑小麥蛋白特性對加工品質的影響主要體現為谷蛋白∶醇溶蛋白比例過高，會造成發酵過程中面團的延展性變差，饅頭硬度提升、咀嚼性增大；從亞基組成及分布來看，冀紫439中高分子量谷蛋白亞基條帶數量少且存在高分子量黑小麥醇溶蛋白，均不利于面團的黏彈性；面筋蛋白的二級結構中，冀紫439的β-折疊含量顯著低于濟麥22，不利于面筋蛋白的穩定性；冀紫439小麥粉氫鍵、二硫鍵作用較濟麥22低，而二者主要促進面筋蛋白聚合和維持面筋網絡穩定。因此，基于冀紫439與濟麥22蛋白組分、亞基組成、二級結構、分子間作用力的差異所帶來的面團緊實、饅頭嚼勁大的結果，確定下一步的研究方向為通過物理改性或酶法修飾來改善黑小麥發酵面制品的適口性。