不同發酵劑對青稞中富集β-葡聚糖的影響

陳瑜，王偉，焦迎春，蔣濤*

（1.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016；2.浙江省農業科學院農產品質量安全與營養研究所，浙江 杭州 310021）

青稞（Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.f.）為禾木科大麥屬植物，抗逆性強，適宜在寒冷的高海拔地區生長，在青藏高原上的種植歷史已有3 500年[1]，是我國青海地區重要的糧食作物[2]。青稞中富含粗纖維、蛋白質、維生素等營養物質，且脂肪、總糖含量低，是適合糖尿病患者食用的主食之一[3]。除此之外，青稞中還含有大量黃酮、多酚、β-葡聚糖、γ-氨基丁酸等生物活性成分[4-5]，使其營養價值更加豐富，是功能食品開發的良好原料，在功能性食品領域具有廣闊的應用前景。青稞中的β-葡聚糖含量遠高于燕麥、小麥等其他谷物作物[5-6]，主要存在于籽粒胚乳細胞壁與糊粉層中，具有調節血脂、血糖、腸胃健康、提高免疫力、抗氧化應激損傷等功能[7-10]，目前已開發出不同形式的功能食品，如β-葡聚糖膠囊、粉劑以及咀嚼片等[11]。

β-葡聚糖主要提取方法有水提法[12]、堿提法[13]、亞臨界萃取法[14]以及超聲波輔助提取法[15]等，但這些方法耗時較長，且獲得的β-葡聚糖純度低，后續仍需純化處理，導致提取β-葡聚糖的工序繁瑣，生產成本較高[16-17]。微生物發酵法是近些年新興的β-葡聚糖提取方法[18]，該法較傳統水提等方法具有成本低、富集量高、發酵條件要求低的優點[19]。張玉良[20]運用黑曲霉菌株發酵富集燕麥麩中β-葡聚糖，結果顯示純度可達52.53%，且溫度對其含量影響顯著，而pH值對β-葡聚糖的含量影響不顯著。劉新琦等[18]通過酵母菌發酵法提取的青稞β-葡聚糖得率為5.21%，比傳統的水提法得率提高了60.80%。微生物生長過程中以還原糖、蛋白質等其他物質作為營養物進行生長，同時利用復雜的酶系統分解碳水化合物，而不消耗青稞中β-葡聚糖[21-22]，從而可以達到提高β-葡聚糖得率及去雜純化的效果。此外部分微生物在生長過程中會產生一些含有β-葡聚糖的黏液[23]，所以利用發酵法提取青稞中的β-葡聚糖可以使植物以及微生物中的β-葡聚糖得到更好的應用。

目前，通過微生物富集β-葡聚糖的工藝多采用單一菌種發酵，復合菌種發酵法富集β-葡聚糖的研究較少。本試驗以高活性干酵母、釀酒干酵母、葡萄酒酵母、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌6種菌種對青稞進行單菌發酵以及復合菌發酵，通過分析對比以及響應面試驗篩選出最優復合發酵劑和最優發酵工藝，并對發酵富集得到的β-葡聚糖抗氧化活性進行了測定，以期為微生物發酵法富集β-葡聚糖、生產富含β-葡聚糖的青稞功能食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

帶皮黑青稞：青海鑫寧生物科技有限公司；高活性干酵母、釀酒干酵母、葡萄酒酵母[屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）類的不同類產品]：安琪酵母有限公司；植物乳桿菌LK-1（Lactiplantibacillus plantarum LK-1）：青海大學農牧學院微生物實驗室保藏；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）：鄭州百益寶生物技術有限公司；β-葡聚糖標準品（純度≥95%）：美國 Sigma公司；維生素 C（＞99.0%）：河北源創生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽 [2，2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]（均為分析純）：北京索萊寶生物科技有限公司；苯酚、無水乙醇、硼酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、重蒸試劑、次氯酸鈉、剛果紅、二甲基亞砜、硫酸鉀（均為分析純）：上海長青化工有限公司。

1.2 儀器與設備

鼓風干燥箱（101-3AB）：上海川宏實驗儀器有限公司；恒溫水浴振蕩器（SHA-B）；艾爾斯儀器制造有限公司；生化培養箱（SPX-250B-Z）：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；紫外可見分光光度計（UV-6600）：上海科那美科學儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（YM50）：上海沙鷹科學儀器有限公司；臺式高速離心機（GL-168）：德國Eppendorf公司；超凈工作臺（ZHJH-C1112B）：上海智城分析儀器制造有限公司；多功能粉碎機（HY-400）：北京恒奧德儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵法富集青稞中的β-葡聚糖

準確稱取4.5 g青稞粉于150 mL錐形瓶中，加入54 mL蒸餾水，即料液比為1∶12（g/mL），高壓蒸汽滅菌鍋105℃滅菌20 min。取出冷卻后，在超凈工作臺中加入青稞粉質量5%（質量分數）的菌粉，于恒溫發酵箱中34℃發酵26 h。調發酵液pH值為6.0，按4 U/g加入耐高溫α-淀粉酶，水浴溫度90℃～95℃進行酶解去淀粉30min，碘液檢測不含淀粉為止，冷卻至室溫。將除去淀粉的發酵液放入離心機，設置轉速5 000 r/min離心15 min。收集上清液，加入3倍體積95%乙醇，醇沉3 h。收集沉淀真空冷凍干燥，得到青稞β-葡聚糖粗品。

1.3.2 熱水浸提法提取青稞β-葡聚糖

參考李楠等[24]關于水提裸燕麥β-葡聚糖條件的優化方法并加以改進。具體工藝：準確稱取4.5 g青稞粉于150 mL錐形瓶中，加入54 mL蒸餾水，即料液比為 1∶12（g/mL），在 52℃下提取 3 h。取出冷卻后，調節發酵液pH值為6.0，按4 U/g加入耐高溫α-淀粉酶，水浴溫度90℃～95℃進行酶解去淀粉30 min，碘液檢測不含淀粉為止，冷卻至室溫后，同1.3.1中的試驗方法，得到青稞β-葡聚糖粗品。

1.3.3 青稞β-葡聚糖得率的測定

采用剛果紅標準曲線法得到β-葡聚糖標準曲線方程：y=6.664x+0.022 2，R2=0.998 7。測定青稞提取物中β-葡聚糖含量，按下述公式計算青稞β-葡聚糖得率[25]。

式中：M1為提取的青稞β-葡聚糖質量，g；M為干燥的青稞原料質量，g。

1.3.4 青稞β-葡聚糖發酵富集的條件優化

1.3.4.1 菌種篩選及復配條件確定

固定基本條件為接種量5%（菌種/黑青稞粉，g/100 g），料液比 1∶12（g/mL），發酵時間 26 h，發酵溫度34℃。研究不同菌種（高活性干酵母、釀酒干酵母、葡萄酒酵母、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）、不同復配比（高活性干酵母∶釀酒干酵母∶嗜熱鏈球菌）1∶1∶1、2∶1∶1、3∶1∶1（質量比）對青稞麩皮 β-葡聚糖得率的影響。

1.3.4.2 單因素試驗

以黑青稞為發酵底物，固定料液比1∶12（g/mL）、接種量5%、發酵時間26 h，發酵溫度34℃。分別考察接種量（3%、4%、5%、6%、7%）、發酵時間（22、24、26、28 h）和發酵溫度（30、32、34、36℃）對發酵富集青稞 β-葡聚糖的影響，根據單因素試驗結果和實際情況，選出對β-葡聚糖得率影響顯著的因素進行響應面試驗。

1.3.4.3 響應面優化試驗

參考程洋洋等[25]的方法，根據單因素試驗結果，對發酵影響較顯著的3個因子發酵溫度（A）、接種量（B）、發酵時間（C）設計三因素三水平的Box-Behnken中心復合試驗，測定各組β-葡聚糖得率并作為響應值，共設計17組試驗，試驗設計因素水平及編碼見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.5 體外抗氧化活性的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

參考DPPH自由基清除法[26-27]，用95%乙醇配制0.1 mmol/L DPPH溶液，取2 mL不同濃度待測樣品加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，避光反應30 min后5 000 r/min離心5 min，取上清液在517 nm處測定吸光值，以蒸餾水代替上述操作中的樣品溶液為空白組調零。以VC做陽性對照，重復3次取平均值，并按下列公式計算DPPH自由基清除率。

DPPH 自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

式中：A0為空白組吸光值；A1為樣品組吸光值；A2為無水乙醇代替DPPH反應液所得吸光值。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除率的測定

參考ABTS+自由基清除法[27-28]，以蒸餾水為溶劑配制7 mmol/L ABTS溶液與2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液后分別定容至10 mL，在燒杯中混合，避光保存12 h后即為ABTS儲備液，然后用無水乙醇將其稀釋成734 nm下OD值為（0.70±0.02），即得ABTS工作液。將1 mL樣品-無水乙醇稀釋液與2 mL ABTS工作液在5 mL離心管中混勻，避光反應10 min，于734 nm處測定吸光值A1，無水乙醇代替樣品測得吸光值A0，無水乙醇代替ABTS工作液測得吸光值A2，用無水乙醇調零，以VC為陽性對照，平行操作重復3次，ABTS+自由基清除率按下式計算。

ABTS+自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100

1.4 數據處理與分析

所有試驗均重復3次，采用Origin 8作圖，單因素試驗均采用SPSS Statistics 23進行數據分析，采用One-Way ANOVA進行單因素方差分析，采用Duncans'法進行多重比較檢驗，采用Design-Expert 13軟件進行響應面試驗設計及數據處理與分析。

2 結果與討論

2.1 富集菌種及復配條件對青稞β-葡聚糖得率的影響

2.1.1 富集菌種對青稞β-葡聚糖得率的影響

選擇6種常用的菌種作為富集β-葡聚糖的菌種，分別為高活性干酵母、釀酒干酵母、葡萄酒酵母、植物乳桿菌LK-1、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，添加量均為青稞粉質量的5%，不同菌種對β-葡聚糖得率的影響如圖1所示。

圖1 不同菌種對青稞β-葡聚糖得率的影響Fig.1 Yield of β-glucan from highland barley fermented with different strains

由圖1可知，微生物發酵法提取青稞中β-葡聚糖效果均顯著高于熱水浸提法。這可能是因為發酵過程中，微生物豐富的酶系統使青稞中的大分子物質被更好的利用分解，從而溶解出較多的β-葡聚糖，提高β-葡聚糖的提取效率。其中，高活性干酵母發酵提取的β-葡聚糖得率最高，這可能是因為糊化后的青稞發酵液中充足的碳源使酵母菌的活性較高，從而解離出較多的β-葡聚糖。釀酒干酵母與嗜熱鏈球菌發酵富集的β-葡聚糖得率較熱水浸提法分別提高了55%和56%，差異顯著（P＜0.05）。因此，根據發酵液中β-葡聚糖得率篩選出高活性干酵母、釀酒干酵母、嗜熱鏈球菌進行下一步試驗。

2.1.2 復配條件對青稞β-葡聚糖得率的影響

不同復配比對青稞β-葡聚糖得率的影響結果見圖2。

由圖2可知，隨著高活性干酵母∶釀酒干酵母∶嗜熱鏈球菌復配比的增大，發酵液中的β-葡聚糖得率呈先增加后減少的趨勢。當高活性干酵母釀酒干酵母、嗜熱鏈球菌復配比為2∶1∶1時β-葡聚糖得率最高為（31.14±0.07）%，與其他提取條件相比差異顯著（P＜0.05），說明在此復配比下的青稞發酵液中微生物的比例較為平衡，彼此之間不存在相互競爭，但隨著復配比的增加，發酵液中微生物的數量過多，而發酵液已經不能夠為微生物提供充足的營養成分，彼此之間出現了相互競爭，所以導致β-葡聚糖得率減少。因此選擇2∶1∶1為最佳復配比富集β-葡聚糖。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 接種量對青稞β-葡聚糖得率的影響

不同接種量對青稞β-葡聚糖得率的影響結果見圖3。

圖3 接種量對青稞β-葡聚糖得率的影響Fig.3 Effect of inoculum on yield of β-glucan from highland barley

由圖3可知，隨著接種量的增加，β-葡聚糖的得率先增加后趨于穩定，接種量太少時β-葡聚糖無法充分釋放，接種量增大后得率也隨著增大；當接種量為5%時，β-葡聚糖得率為25.64%，與接種量為6%、7%結果無顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于接種量3%、4%（P＜0.05），說明過大的接種量增加了釀酒干酵母、嗜熱鏈球菌、高活性干酵母菌的消耗，對富集β-葡聚糖無效果，因此選取接種量5%。

2.2.2 發酵時間對青稞β-葡聚糖得率的影響

不同發酵時間對青稞β-葡聚糖得率的影響結果見圖4。

圖4 發酵時間對青稞β-葡聚糖得率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on yield of β-glucan from highland barley

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，β-葡聚糖得率逐漸增加，在26 h時達到最高值，之后逐漸下降。發酵26 h與發酵22 h時的β-葡聚糖得率相比，提高了26.19%，差異顯著（P＜0.05），可能是因為前 24 h菌種開始利用自身的酶系統發酵分解纖維素，到26 h時反應完全，因此最佳發酵時間為26 h。

2.2.3 發酵溫度對青稞β-葡聚糖得率的影響

不同發酵溫度對青稞β-葡聚糖得率的影響結果見圖5。

圖5 發酵溫度對青稞β-葡聚糖得率的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on yield of β-glucan from highland barley

由圖5可知，隨著發酵溫度升高，青稞β-葡聚糖的得率逐漸增加，在34℃達到峰值之后下降，與30℃條件下的β-葡聚糖得率相比較，34℃時提高70.20%，差異顯著（P＜0.05）。這可能是由于溫度升高，分子熱運動加快，導致單位時間內β-葡聚糖的溶出率升高。因此確定最佳發酵溫度為34℃。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性分析

從上述單因素試驗結果可知，發酵溫度（A）、接種量（B）、發酵時間（C）對富集β-葡聚糖效果顯著，以接種量5%、發酵溫度34℃、發酵時間26 h為中心點，β-葡聚糖得率為響應值進行響應面優化，響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface test

使用軟件JMP11對試驗數據進行多元回歸分析，得到二次多項響應面回歸模型：Y=42.42-0.0625A+2.49B+1.78C+0.35AB+1.83AC+0.1750BC-8.46A2-11.41B2-9.53C2。

對響應面試驗得到的結果進行方差分析和顯著性檢驗，結果見表3。

表3 方差分析及顯著性檢驗Table 3 ANOVA and significance test

分析表3可知，響應面回歸模型的F值為93.72，達到極顯著水平（P＜0.000 1），表明該模型顯著；由F值大小得知，各因素對β-葡聚糖得率的影響大小順序為接種量（B）＞發酵時間（C）＞發酵溫度（A），其中接種量（B）和發酵時間（C）為極顯著因素；交互項中AC為顯著因素（P＜0.05），二次項中 A2、B2、C2為極顯著因素（P＜0.01），說明以上顯著因素和極顯著因素與β-葡聚糖得率之間存在明顯的數學關系；失擬項不顯著（P=0.163 9＞0.05），相關系數R2=0.991 8，校正系數R2adj=0.981 2，表明該模型擬合效果良好，98.12%的β-葡聚糖得率變化值可通過該模型解釋，能較好地反映試驗中3個影響因素與響應值的變化情況；變異系數為4.61%＜15.00%，信噪比為24.78%＞4%，表明該模型試驗誤差小、可靠性高。

2.3.2 響應面交互作用分析

為探究雙因素交互作用對β-葡聚糖得率的影響，利用Design-Expert 13軟件對試驗數據進行交互作用分析。先固定3個因素中的1個因素在零水平，再分析另外兩個因素的交互作用，若響應曲面坡度越陡峭，說明因素影響越大，反之影響越小。

當發酵時間固定時，發酵溫度和接種量相互作用見圖6。

圖6 發酵溫度與接種量的交互作用Fig.6 Interaction between fermentation temperature and inoculum

由圖6可知，發酵時間固定時，發酵溫度和接種量相互作用獲得的響應面圖較為平緩，說明發酵溫度與接種量間的相互作用變化對β-葡聚糖得率的影響不顯著，并且該結果與方差分析結果一致。

當接種量固定時，發酵時間和發酵溫度相互作用見圖7。

圖7 發酵溫度與發酵時間的交互作用Fig.7 Interaction between fermentation temperature and fermentation time

由圖7可知，在接種量一定時，發酵時間和發酵溫度相互作用獲得的響應面圖較為陡峭，說明發酵時間與發酵溫度的相互作用變化對β-葡聚糖得率的影響顯著，并且該結果與方差分析結果一致。

當發酵溫度固定時，發酵時間和接種量相互作用見圖8。

圖8 接種量與發酵時間的交互作用Fig.8 Interaction between inoculum and fermentation time

由圖8可知，在發酵溫度一定時，發酵時間與接種量之間的相互作用獲得的響應面圖較為平緩，說明發酵時間與接種量間的相互作用變化對β-葡聚糖得率的影響不顯著，并且該結果與方差分析結果一致。

2.4 驗證試驗

將4.5 g的青稞按照料液比1∶12（g/mL）制成青稞液，采用復配比為高活性干酵母∶釀酒干酵母∶嗜熱鏈球菌 2∶1∶1（質量比）的復合菌種為發酵劑，以青稞 β-葡聚糖得率為指標，經過Design-Expert 13軟件優化處理后，得到最佳發酵工藝：接種量5%、發酵溫度34℃，發酵時間26 h，在此條件下β-葡聚糖得率為（42.80±0.17）%，試驗值與預測值（42.43%）相近，說明建立的模型可靠。

2.5 青稞β-葡聚糖體外抗氧化活性分析

2.5.1 青稞β-葡聚糖對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是以氮原子為中心的自由基，能在短時間內測定物質的抗氧化能力[29]。以VC為對照，不同濃度青稞β-葡聚糖和VC的DPPH自由基清除率如圖9所示。

圖9 青稞β-葡聚糖對DPPH自由基的清除能力Fig.9 DPPH-scavenging ability of β-glucan from highland barley

由圖9可知，青稞β-葡聚糖和VC對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增大而增大，且VC的清除作用大于β-葡聚糖的清除作用，當濃度達到1.0 mg/mL時，VC和青稞β-葡聚糖對DPPH自由基的清除率分別為（93.79±0.12）%、（58.62±0.10）%，VC的 DPPH 自由基清除率是青稞β-葡聚糖的1.6倍。由此說明，經發酵富集的青稞β-葡聚糖具有一定的DPPH自由基清除能力。

2.5.2 青稞β-葡聚糖對ABTS＋自由基的清除作用

不同濃度青稞β-葡聚糖和VC的ABTS＋自由基清除率如圖10所示。

圖10 青稞β-葡聚糖對ABTS＋自由基的清除能力Fig.10 ABTS+-scavenging ability of β-glucan from highland barley

由圖10可知，青稞β-葡聚糖和VC對ABTS＋自由基的清除率隨著濃度的增大而增大，且VC的清除作用一直大于青稞β-葡聚糖的清除作用，當濃度達到1.0mg/mL，VC和青稞β-葡聚糖對ABTS＋自由基的清除率分別（96.59±0.11）%、（68.06±0.07）%。即 VC的 ABTS＋自由基清除率是青稞β-葡聚糖ABTS＋自由基清除率的1.42倍。

3 結論

采用不同微生物發酵富集青稞β-葡聚糖，對其最佳富集工藝進行研究，以VC為對照，研究青稞β-葡聚糖的抗氧化能力。結果表明，在料液比為1∶12（g/mL）的青稞發酵液中按照復配質量比為2∶1∶1（高活性干酵母∶釀酒干酵母∶嗜熱鏈球菌）接種青稞質量分數5%的菌種，于34℃發酵26h；在此條件下富集的β-葡聚糖得率可達到42.80%，與富集前相比提高了63.01%，差異顯著（P＜0.05）。同時相較于單一發酵劑，復合發酵劑在適宜的發酵時間、發酵溫度、接種量、復配比下更能富集β-葡聚糖，提高β-葡聚糖得率。當濃度達到1.0 mg/mL時，青稞β-葡聚糖的DPPH自由基、ABTS＋自由基清除率分別為（58.62±0.10）%和（68.06±0.07）%。綜上表明，可以通過發酵法富集青稞中的β-葡聚糖，使青稞β-葡聚糖具備良好的抗氧化能力，有較好的應用前景。