大豆胚芽甾醇酯的分離純化

姚雙燕，張沁強，竇偉國，彭丹，畢艷蘭，陳競男

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

我國大豆的年消費量已經連續四年超過1億t，其中大豆的加工量約占消費總量的84%[1]。大豆胚芽是低溫豆粕制取的副產物之一，占大豆總質量的2.0%～2.5%[2]。大豆胚芽中含有豐富的粗蛋白和粗脂肪，此外包含豐富的天然活性物質，如植物甾醇、大豆異黃酮、大豆磷脂、維生素E、角鯊烯等[3-4]。其中植物甾醇是一種天然存在于豆類、種子、谷物、堅果、水果中以環戊烷多氫菲為基本骨架的活性甾族類化合物[5-6]。研究發現植物甾醇能夠在脂肪微團的運輸和吸收過程中與膽固醇競爭，減少膽固醇的吸收，從而降低血液中總膽固醇和低密度脂蛋白濃度，有效預防心腦血管疾病[7-9]。

在食品工業中，植物甾醇多數通過脫臭餾出物皂化得到，主要以游離態形式存在，而游離態甾醇的溶解性較差，生物利用性較低[10-11]。因此，工業上常將游離甾醇與脂肪酸酯化，再以甾醇酯的形式加以利用。大豆胚芽中的植物甾醇資源含量豐富，前期研究發現大豆胚芽毛油中甾醇含量約為4%，其中，酯態甾醇約占80%，是一種極好的天然植物甾醇酯資源。然而，目前工業生產中大豆胚芽多作為加工副產物應用于飼料行業，對其活性組分的開發也主要集中于大豆胚芽中的異黃酮和皂甙等[12-14]，對大豆胚芽油脂及其豐富的植物甾醇（酯）資源并未充分開發利用，造成了資源的極大浪費。

相較于傳統的皂化再酯化生產植物甾醇酯工藝，本研究直接從富含植物甾醇酯的大豆胚芽粗提物中分離純化甾醇酯。采用柱層析的方法對大豆胚芽粗提物中的甾醇酯進行分離純化，通過正交試驗優化最佳工藝條件，并對大豆胚芽甾醇酯產品進行表征，為大豆胚芽的開發利用與植物甾醇酯的工業化生產提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與設備

大豆胚芽（粗蛋白41.45%、粗脂肪10.46%、水分9.34%、粗纖維7.49%）：山東香馳豆業集團有限公司；正己烷、石油醚、吡啶、氫氧化鉀、冰乙酸、無水乙醇（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；中性氧化鋁（100目～200目、200目～300目）、硅膠粉（100目～200目、200目～300目）：青島海洋化工有限公司；乙醚、丙酮、三氯甲烷（分析純）：四川西隴科學有限公司；膽固醇硬脂酸酯標準品、膽甾烷醇標準品：美國Sigma公司；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）：阿拉丁試劑有限公司。

2695高效液相色譜儀：美國Waters公司；7890氣相色譜儀、7890A-5975C氣質聯用儀：安捷倫科技有限公司；370DTGS傅里葉紅外光譜儀：美國PE公司；FW-100高速粉碎機：永康市紅太陽機電有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆胚芽粗提物的制備

將大豆胚芽放置于鼓風干燥箱中干燥（80℃，7 h），通過高速粉碎機將大豆胚芽粉碎至100目，過篩備用。稱取一定質量的大豆胚芽粉末，分別用無水乙醚、無水乙醇、石油醚、丙酮、正己烷、氯仿對大豆胚芽粉末進行索氏抽提，溫度設定為高于提取溶劑沸點15℃，抽提10 h，提取結束后旋轉蒸發除去多余溶劑，將得到的大豆胚芽粗提物放置于70℃真空干燥箱中干燥至恒重。以大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量為指標，選取最佳提取溶劑。大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量按式（1）和（2）計算。

氣相色譜條件：儀器AgilentGC7890；色譜柱DB-1ht（30m×320μm×0.25μm）；載氣為氮氣；流速 3.0mL/min；初始柱溫100℃，50℃/min升至300℃保持5 min，20℃/min升至360℃保持15 min；進樣口溫度350℃；FID 檢測器溫度 350 ℃；分流比 20∶1；進樣量 1 μL。

1.2.3.1 吸附劑種類對大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

以正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（體積比）為洗脫劑比例，12∶1為層析柱高度與直徑比（H/D），2.0 g為上樣

1.2.2 大豆胚芽粗提物的理化性質分析

水分及揮發物含量參考GB 5009.236—2016《食品安全國家標準動植物油脂水分及揮發物的測定》測定；酸價參考GB 5009.229—2016《食品安全國家標準食品中酸價的測定》測定；過氧化值參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標準食品中過氧化值的測定》測定；皂化值參考GB/T 5534—2008《動植物油脂皂化值的測定測定》；不皂化物含量參考GB/T 5535.2—2008《動植物油脂不皂化物測定第2部分：己烷提取法》測定；生育酚含量參考Huang等[15]的方法測定；總甾醇含量參考GB/T 25223—2010《動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法》測定；游離甾醇含量參考李妲汨等[16]的方法測定。

1.2.3 柱層析純化甾醇酯單因素試驗

稱取一定質量的大豆胚芽粗提物，并配制不同體積比的洗脫劑（正己烷∶乙醚∶乙酸）待用。稱取適量的吸附劑于燒杯中，倒入適量的洗脫劑混勻并用漏斗注入層析柱中，使吸附劑沉降，用壓力球加壓至吸附劑壓實。將稱取的大豆胚芽粗提物均勻添加至制備好的層析柱中，洗脫至甾醇酯全部流出（用薄層色譜進行判斷），收集甾醇酯組分旋轉蒸發除去溶劑，在真空干燥箱中干燥至恒重后稱重。以膽固醇硬脂酸酯為標準品，采用氣相色譜測定其純度并按式（3）計算得率。量，考察4種吸附劑對柱層析分離純化甾醇酯的影響。

1.2.3.2 洗脫劑體積比對大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

在上樣量2.0 g，填充劑200目～300目硅膠粉，H/D12∶1條件下，選取不同極性比例的洗脫劑分離純化甾醇酯，考察5種洗脫劑體積比對甾醇酯純度和得率的影響，洗脫劑極性大小見表1。

表1 不同體積比洗脫劑的總極性Table 1 Total polarity of different eluent ratios

1.2.3.3 上樣量對大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

以200目～300目硅膠粉為層析柱填充劑，正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（體積比）為洗脫劑比例，H/D12∶1，考察上樣量（0.5、2、3、4、5 g）對柱層析純化甾醇酯得率和純度的影響。

1.2.3.4 填柱高度與直徑比（H/D）對大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

以200目～300目硅膠粉為層析柱填充劑，正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（體積比）為洗脫劑比例，上樣量 2.0 g，考察填柱高度與直徑比 H/D（8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1）對柱層析純化甾醇酯得率與純度的影響。

1.2.4 正交試驗

依據單因素試驗結果，以 H/D（A）、上樣量（B）、洗脫劑比例（C）為變量，以大豆胚芽甾醇酯的得率及純度為考察指標，通過正交試驗優化出大豆胚芽甾醇酯最佳分離純化工藝條件。正交試驗因素水平見表2。

表2 L9（33）純化工藝正交因素水平表Table 2L9（33）orthogonal factors and levels for the purification process

1.2.5 大豆胚芽甾醇酯產品的表征

1.2.5.1 甾醇酯純化產品的高效液相色譜分析

將純化后的大豆胚芽甾醇酯與膽固醇硬脂酸酯標準品溶于色譜純正己烷，分別進行高效液相色譜分析，分析條件：硅膠色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；進樣量10 μL；柱溫30℃；采用等度洗脫，流動相為正己烷-異丙醇（體積比=20∶1），流速 0.8mL/min；紫外檢測波長210 nm。

1.2.5.2 甾醇酯純化產品的紅外光譜分析

將溴化鉀壓成薄片，放入傅里葉紅外光譜儀掃描背景，再將待測樣品置于溴化鉀薄片上，使其均勻分布。分析條件為采樣32次，掃描范圍4 500 cm-1～400 cm-1。

1.2.5.3 大豆甾醇酯的甾醇組成及脂肪酸組成分析

將純化后的甾醇酯產品用KOH-乙醇溶液于80℃皂化1.5 h，酸化后用正己烷萃取不皂化物，旋轉蒸發除去溶劑并對其進行薄層色譜分離，分別得到甾醇酯上的甾醇及脂肪酸色譜帶。

采用氣質聯用色譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對甾醇酯上的甾醇組成進行分析，條件為色譜柱 HP-5（30 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度290℃；FID檢測器溫度360℃；分流比20∶1；載氣為氮氣，流速1.0 mL/min；進樣量1 μL。離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電離電壓70 eV；掃描范圍33 m/z～650 m/z。采用氣相色譜檢測甾醇酯上的脂肪酸組成，條件：色譜柱 SGEBPX-70（30 m×250 μm×0.25μm）；進樣口溫度250℃；分流比20∶1；FID檢測器溫度250℃；氫氣流量40 mL/min；空氣流量400 mL/min；柱箱初始溫度170℃，以2℃/min升至210℃，保持20 min；載氣為氮氣，流速 1.0 mL/min；進樣量 1.0 μL。

2 結果與分析

2.1 大豆胚芽粗提取的制備

不同提取溶劑對大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量的影響結果見圖1。

圖1 不同溶劑對大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量的影響Fig.1 Effect of different solvents on crude extract yield and sterol ester content

由圖1可見，石油醚為提取溶劑時，大豆胚芽粗提物中甾醇酯含量最高，達到（4.15±0.02）g/100 g，說明石油醚對甾醇酯的溶解性和選擇性較好，其次為丙酮，甾醇酯含量為（3.92±0.37）g/100 g。除此之外，乙醇為提取溶劑時，大豆胚芽提取物得率最高，為（11.30±0.04）%，這可能因為大豆胚芽中醇溶性物質較多，如大豆異黃酮、低聚糖、醇溶蛋白等[17]，但乙醇極性較大，對甾醇酯溶解性較差，因此其中甾醇酯含量較低[（0.99±0.19）g/100g]；綜合考慮溶劑的毒性、價格、沸點等因素[18]，本試驗選擇石油醚作為大豆胚芽粗提物的提取溶劑。

2.2 大豆胚芽粗提物的主要理化指標分析

大豆胚芽粗提物的主要理化指標結果見表3。

表3 大豆胚芽粗提物理化指標Table 3 Physical and chemical indicators of soybean germ crude extract

由表3可知，大豆胚芽粗提物中植物甾醇含量（4.69 g/100 g粗提物）高于小麥胚芽油（0.86 g/100 g油）、玉米胚芽油（1.10 g/100 g油）、米糠油（1.00 g/100 g油）[19-20]。

2.3 柱層析分離純化大豆胚芽甾醇酯的單因素試驗

2.3.1 吸附劑種類對大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

4種吸附劑對柱層析分離純化甾醇酯的影響結果見圖2。

圖2 吸附劑種類對甾醇酯純度和得率的影響Fig.2 Effect of adsorbent type on the purity and yield of sterol esters

由圖2可知，隨著2種吸附劑目數的增大，甾醇酯的得率及純度均有所提高。這是由于200目～300目的吸附劑相較于100目～200目，顆粒較小，洗脫劑流經柱子時阻力較大，流速較慢，沖柱時間較長，更利于甾醇酯的吸附與解吸[21-22]，使得甾醇酯與其他極性相似組分分離（如甘三酯）。當吸附劑目數相同時，硅膠粉的得率及純度均高于氧化鋁。如吸附劑為100目～200目氧化鋁時，甾醇酯純度為（86.51±1.34）%，得率為（75.09±0.16）%，而吸附劑為相同目數的硅膠粉時，甾醇酯的純度和得率分別為（90.73±0.46）%、（85.81±2.44）%。這是由于氧化鋁極性大于硅膠粉，使得提取物中極性較小的組分被較快洗脫出來，但因洗脫時間較短，分離效果較差。因此選擇200目～300目硅膠粉為柱層析的吸附劑。

2.3.2 洗脫劑體積比對大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

洗脫劑體積比對大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響見圖3。

圖3 洗脫劑體積比對甾醇酯純度和得率的影響Fig.3 Effect of eluent ratio on the purity and yield of sterol esters

由圖3可見，甾醇酯得率隨著總極性的增加先增大后減小，這可能由于洗脫劑總極性較小時，對甾醇酯洗脫能力較強，較易將其從層析柱中洗脫，當洗脫劑（正己烷∶乙醚∶乙酸）體積比為 90∶10∶1 時，甾醇酯的得率達到最高。隨著洗脫劑總極性的增大，對甾醇酯的分離效果差，致使得率降低。當洗脫劑體積比在 95∶5∶1～85∶15∶1 時，甾醇酯純度隨洗脫劑總極性變化較小，無顯著性差異，隨著洗脫劑總極性增大，甾醇酯純度明顯降低。這可能由于甾醇酯與其他組分在不同極性的洗脫劑下分離效果不同。當洗脫劑（正己烷∶乙醚∶乙酸）體積比為90∶10∶1時，甾醇酯的得率[（94.36±1.77）%]及純度[（96.80±0.16）%]均達到最高，因此，選擇正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（體積比）為最佳洗脫劑比例。

2.3.3 上樣量對大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

上樣量對柱層析純化甾醇酯得率和純度的影響結果見圖4。

圖4 上樣量對甾醇酯純度和得率的影響Fig.4 Effect of loading volume on the purity and yield of sterol esters

由圖4可見，甾醇酯得率及純度隨著上樣量的增加逐漸下降，在上樣量為2.0 g時，甾醇酯的純度及得率達到最高，純度和得率分別為（95.70±0.16）%與（94.30±1.45）%。繼續加大上樣量至3.0 g時，通過SPSS進行數據分析，發現與2.0 g相比，兩者純度無顯著差異，（P＞0.05），但甾醇酯的得率顯著下降。這是因為層析柱對樣品的負載能力是一定的[17]，應在層析柱的負載范圍內選擇最大的上樣量，因此柱層析最佳上樣量選擇2.0 g。

2.3.4 填柱高度與直徑比（H/D）對大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

填柱高度與直徑比（H/D）對柱層析純化甾醇酯得率與純度的影響結果見圖5。

圖5 填柱高度與直徑比（H/D）對甾醇酯純度和得率的影響Fig.5 Effect of height to diameter ratio（H/D）of column on the purity and yield of sterol esters

如圖5所示，H/D對甾醇酯純度影響較小，隨著H/D的增加，甾醇酯純度基本不變。而甾醇酯的得率隨著H/D的升高先增大后基本保持不變，當柱層析H/D為12∶1時，甾醇酯的純度及得率均較高，分別為（96.65±0.12）%、（94.56±1.01）%。繼續增加 H/D 至 16∶1時，甾醇酯的得率達到最佳（94.76±0.04）%，這是由于填充劑的高度決定樣品在層析柱中的遷移長度，遷移長度越長，越有利于甾醇酯的分離純化。但通過SPSS分析發現，H/D 為 12∶1、14∶1、16∶1 時，甾醇酯的得率及純度均無顯著性差異，考慮到耗材節約，選擇12∶1作為最佳H/D。

2.4 柱層析純化甾醇酯的正交試驗

正交試驗設計及結果見表4，方差分析見表5，其中綜合分數為0.5×純度+0.5×得率。

表4 正交試驗設計及結果Table 4 Orthogonal experimental design and results

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表4可知，各因素對甾醇酯分離純化效果的主次順序為：C＞B＞A，最佳工藝組合為 A2B2C2，即填充柱高度與直徑比 12∶1，上樣量 2.0 g，洗脫劑（正己烷∶乙醚∶乙酸）體積比90∶10∶1，在最佳條件下進行驗證試驗，甾醇酯純度為（96.11±0.41）%，得率為（94.99±0.19）%。

2.5 大豆胚芽甾醇酯的表征

2.5.1 甾醇酯純化產品的高效液相色譜分析

以膽固醇硬脂酸酯為標準品，通過高效液相色譜對純化產品進行定性分析，結果見圖6。

圖6 膽固醇硬脂酸酯與大豆胚芽甾醇酯的高效液相色譜圖Fig.6 High-performance liquid chromatograms of cholesteryl stearate and soybean germ sterol esters

由圖6可知，大豆胚芽甾醇酯的出峰時間為4 min左右，與膽固醇硬脂酸酯標準品出峰時間相近，說明純化產物為甾醇酯。

2.5.2 甾醇酯純化產品的紅外光譜分析

采用紅外光譜對純化后的大豆胚芽甾醇酯進行表征，結果如圖7所示。

圖7 大豆胚芽甾醇酯的紅外光譜Fig.7 Infrared spectrum of soybean germ sterol esters

由圖7可知，大豆胚芽甾醇酯在1 744.20 cm-1處有明顯的吸收峰，是典型的CO紅外吸收峰；在1 173.10 cm-1有吸收峰，為酯鍵O—C—O吸收峰。說明分離純化出的產物為甾醇酯。

2.5.3 甾醇酯純化產品的氣質聯用色譜分析

對純化產品上的甾醇及脂肪酸進行分析，結果見圖8、表6和表7。

圖8 純化產品的甾醇及脂肪酸氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatograms of sterol composition and fatty acids of purified product

表6 氣相質譜分析甾醇的特征離子碎片Table 6 Characteristic ion fragments of sterols analyzed byGC-MS

表7 甾醇酯上甾醇及脂肪酸組成Table 7 Sterol and fatty acid compositions in sterol esters

通過圖8、表6和表7可見，大豆胚芽甾醇酯中甾醇主要組成為菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇等，相對含量分別為（9.12±0.05）%、（3.33±0.02）%、（75.17±0.14）%、（12.37±0.11）%；其脂肪酸組成主要為棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸等，相對含量分別為（7.31±0.74）%、（69.34±0.08）%、（15.72±0.15）%。

3 結論

通過石油醚提取粗提物中甾醇酯含量最高[（4.15±0.02）g/100 g粗提物]，得率為（10.48±0.10）%。柱層析分離純化大豆胚芽甾醇酯的最佳工藝條件為吸附劑200目～300目硅膠粉、洗脫劑（正己烷∶乙醚∶乙酸）體積比90:10∶1、上樣量2.0 g、層析柱高度與直徑比（H/D）12∶1。在最佳分離純化條件下，大豆胚芽甾醇酯的純度為（96.11±0.41）%，得率為（94.99±0.19）%（以大豆胚芽粗提物計）。通過液相色譜及紅外光譜表征證明產物為甾醇酯，使用氣相質譜及氣相色譜分析出大豆胚芽甾醇酯的主要甾醇組成為β-谷甾醇、羊毛甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等；甾醇酯的主要脂肪酸組成為亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸等。