大孔樹脂純化靈芝子實(shí)體和孢子粉中總?cè)?/h1>
2023-02-17 11:41:20祝朋玲張靜李思雨崔馨戈袁抒捷王雯彭燦周俊
食品研究與開發(fā) 2023年4期
祝朋玲，張靜，李思雨，崔馨戈，袁抒捷，王雯，彭燦，2，3，4，5*，周俊
（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；4.安徽省中醫(yī)藥研究院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；5.省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012；6.安徽黃山云樂靈芝有限公司，安徽 宣城 242600）
靈芝（Ganoderma lucidum）是一種具有極高價(jià)值的藥食兩用的靈芝屬真菌，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，具有補(bǔ)氣安神、扶正固本、延年益壽等功效[1]，2019年已被納入“藥食同源”試點(diǎn)工作名單。靈芝孢子粉（Ganoderma lucidum spores powder，GLSP）是靈芝成熟后從真菌中排出來的橢圓形生殖細(xì)胞，包含靈芝的所有遺傳物質(zhì)[2]。靈芝子實(shí)體（Ganoderma lucidum fruiting body，GLFB）和孢子粉除可供藥用外，還可制備成各種保健食品。現(xiàn)代研究表明，靈芝子實(shí)體及孢子粉中均含有三萜類、多糖、氨基酸、甾醇、生物堿等多種活性成分[3-4]，其中三萜類化合物作為靈芝的重要活性成分之一，具有保肝護(hù)肝[5-6]、抗炎[7-8]、降血糖[9]、抗腫瘤[10]、抗氧化[11-12]、神經(jīng)保護(hù)[13]等多種藥理活性，應(yīng)用前景廣泛。
采用乙醇浸提獲得的靈芝三萜提取液中仍存有大量的雜質(zhì)，在對(duì)靈芝三萜進(jìn)行成分分析和活性研究時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的干擾作用，因此需要對(duì)靈芝三萜進(jìn)一步分離純化。到目前為止，對(duì)靈芝三萜類成分的研究多為提取工藝及藥理活性[14-16]，而鮮見針對(duì)靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)频姆蛛x純化研究。大孔樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，具有選擇性高、吸附能力強(qiáng)、富集效果好、再生簡(jiǎn)單、使用周期長(zhǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于三萜等天然產(chǎn)物的分離純化[17]。但目前不同型號(hào)的大孔樹脂對(duì)不同中藥中成分吸附與解吸性能不同，純化工藝也存在差異[18-20]。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，考察不同大孔樹脂分別對(duì)同源靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)拼痔崛∥锏奈脚c解吸性能，確定最佳樹脂類型，優(yōu)化分離純化靈芝總?cè)频墓に嚄l件，為靈芝三萜后續(xù)的深入研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
靈芝（Ganoderma lucidum）：安徽省旌德縣安徽黃山云樂靈芝有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為多孔菌科赤芝子實(shí)體及孢子粉。無水乙醇（分析純）：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；冰醋酸、香草醛、乙酸乙酯（均為分析純）：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；高氯酸（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度：HPLC≥98%，批號(hào)：CHB171229）：成都克洛瑪生物科技有限公司；HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、AB-8、NKA-9、D101 型大孔樹脂：北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；HPD-826型大孔樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
千分之一分析天平（BSA224S-CW）、十萬分之一分析天平（BT25S）：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋（DF-101S）：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-8000）：上海元析分析儀器有限公司；高速離心機(jī)（TG16-WS）：常州市萬豐儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-2102C）：上海智誠(chéng)分析儀器制備有限公司。
1.3 方法
1.3.1 上樣液制備
取干燥的靈芝子實(shí)體粗粉和孢子粉（干樣）各200g，分別加入無水乙醇回流提取兩次，料液比為1∶20（g/mL），每次1.5 h，溫度50℃，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，得干樣含量0.2 g/mL的儲(chǔ)備液，保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)频臐舛葴y(cè)定
1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用無水乙醇溶解，配制成0.2 mg/mL的溶液，保存?zhèn)溆谩＞芰咳?biāo)準(zhǔn)品溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、2.0、2.6 mL于10 mL試管中，于50℃烘箱中揮干乙醇，放冷，精密加入0.2 mL 50 mg/mL的香草醛冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸溶液，混勻，于70℃水浴加熱15 min，取出，冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，在548 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。以A為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得線性回歸方程：A=29.503C+0.0208，R2=0.9970，線性范圍為 4 μg/mL～104 μg/mL。
1.3.2.2 樣品中總?cè)茲舛葴y(cè)定
吸取靈芝子實(shí)體和孢子粉乙醇提取液0.1 mL，于50℃烘箱中揮干乙醇，放冷，其余步驟同1.3.2.1。根據(jù)1.3.2.1中標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算靈芝子實(shí)體和孢子粉乙醇提取液中總?cè)茲舛取?/p>
1.3.3 樹脂的預(yù)處理和含水量的測(cè)定
準(zhǔn)確稱取一定量的 HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、HPD-826、AB-8、NKA-9、D101 型大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后，倒出乙醇及漂浮物，濕法裝柱。繼續(xù)用95%乙醇沖洗樹脂柱，直至流出的乙醇洗脫液與蒸餾水（體積比為1∶1）混合無渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味，且樹脂排列均勻，備用。
取少量大孔樹脂，照2020版《中國(guó)藥典》附錄ⅨH水分測(cè)定法項(xiàng)下第一法-烘干法測(cè)定樹脂含水量。
1.3.4 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸
1.3.4.1 靜態(tài)吸附曲線的繪制
精密稱取預(yù)處理過的8種大孔樹脂，每份相當(dāng)于相應(yīng)的干樹脂2.00 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入20 mL靈芝子實(shí)體和孢子粉上樣液（相當(dāng)于0.1 g干樣/mL），每 10 min 振搖 1 次，每次 10 s，持續(xù) 2 h，并于 0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00 h吸取上清液1 mL，按1.3.2方法測(cè)定吸光度。計(jì)算不同時(shí)間各樹脂對(duì)靈芝總?cè)频奈搅浚⒗L制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。
1.3.4.2 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)
分別精密量取靈芝子實(shí)體和孢子粉上樣液10 mL（相當(dāng)于0.5 g干樣/mL）各9份，加到預(yù)處理好的各型號(hào)大孔樹脂中，靜態(tài)吸附8 h，吸取上清液1 mL，按1.3.2方法測(cè)定吸光度，計(jì)算靈芝總?cè)频臐舛取ｌo態(tài)吸附后的各型號(hào)大孔樹脂過濾后，先用適量的蒸餾水沖洗，抽干，置于250 mL具塞錐錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL于振蕩器中，振蕩12 h，過濾，95%乙醇定容至100 mL，精密量取各濾液1 mL，按1.3.2方法測(cè)定吸光度。按公式（1）～（4）計(jì)算靜態(tài)吸附量、吸附率、解吸率和回收率。
式中：Q為靜態(tài)吸附量，mg/g；C0為上樣液中總?cè)茲舛龋琺g/mL；C1為靜態(tài)吸附后上清液的總?cè)茲舛龋琺g/mL；V 為上樣液體積，mL；W 為干樹脂質(zhì)量，g；G 為吸附率，%；C3為解吸后溶液中總?cè)茲舛龋琺g/mL；D為解吸率，%；R為回收率，%。
1.3.5 大孔樹脂純化靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)乒に噧?yōu)化
1.3.5.1 上樣液濃度的選擇
準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的HPD-500和AB-8型大孔樹脂各5份（均相當(dāng)于干大孔樹脂4 g），采用濕法裝柱，HPD-500大孔樹脂柱床體積（bed volume，BV）為27 mL，AB-8型大孔樹脂柱床體積為25 mL。分別制備濃度為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0g干樣/mL 的上樣液各 10mL，以2 mL/min的流速吸附完全后，先以4 BV的水沖洗，再換用4BV的95%乙醇沖洗，收集洗脫液，測(cè)定總?cè)茲舛龋?jì)算吸附率和總?cè)妻D(zhuǎn)移率（總?cè)妻D(zhuǎn)移率/%＝洗脫液中總?cè)瀑|(zhì)量／上樣液中總?cè)瀑|(zhì)量×100），以確定最佳上樣液濃度。
1.3.5.2 上樣量的選擇
準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的HPD-500和AB-8型大孔樹脂各5份（均相當(dāng)于干大孔樹脂4 g），采用濕法裝柱。精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實(shí)體的上樣液和0.4 g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液各100 mL，以2 mL/min的流速上柱，每5 mL收集一份流出液，并測(cè)定每份流出液中的總?cè)茲舛取Ｒ粤鞒鲆悍輸?shù)為橫坐標(biāo)，流出液中總?cè)茲舛葹榭v坐標(biāo)，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線。
1.3.5.3 最適洗脫溶劑濃度的確定
精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實(shí)體的上樣液2 BV和0.4g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液3BV，以2mL/min的流速通過HPD-500和AB-8型大孔樹脂柱，分別用蒸餾水、20%、40%、50%、60%、75%、85%和95%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫劑用量均為4 BV，分段收集洗脫液，測(cè)定總?cè)茲舛取?/p>
1.3.5.4 洗脫劑用量的考察
精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實(shí)體的上樣液2 BV和0.4g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液3BV，以2mL/min的流速分別通過HPD-500和AB-8型大孔樹脂柱，并分別用75%乙醇、95%乙醇進(jìn)行洗脫，直至流出液無色，每5 mL接收1次流出液，每隔0.5 BV洗脫液測(cè)定其中總?cè)茲舛取?/p>
1.3.5.5 驗(yàn)證試驗(yàn)
為了考察最佳工藝條件的穩(wěn)定性，在上述篩選的最佳工藝條件下，采用HPD-500和AB-8型大孔樹脂分別純化靈芝子實(shí)體和孢子粉三萜粗提物，分別進(jìn)行平行試驗(yàn)3次。洗脫液濃縮、烘干至恒重后得到純化產(chǎn)物，按照1.3.2方法測(cè)定總?cè)坪俊?/p>
1.4 數(shù)據(jù)處理
所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin進(jìn)行圖表繪制，通過Excle軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
2 結(jié)果與分析
2.1 大孔吸附樹脂含水量
8種大孔樹脂的含水量測(cè)定結(jié)果見表1。
表1 樹脂含水量Table 1 Water content of resin
2.2 靜態(tài)吸附曲線
8種大孔樹脂對(duì)GLFB和GLSP總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線見圖1和圖2。
圖1 8種大孔樹脂對(duì)GLFB總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線Fig.1 Static adsorption curves of macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum fruiting body（GLFB）
圖2 8種大孔樹脂對(duì)GLSP總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線Fig.2 Static adsorption curves of macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum spore powder（GLSP）
由圖1和圖2可知，0～2 h時(shí)，8種大孔樹脂對(duì)靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)频奈搅吭龃筝^快，2 h～8 h內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸平緩，說明在2 h時(shí)吸附量都已基本達(dá)到平衡，大孔樹脂對(duì)靈芝總?cè)频奈搅口呌陲柡汀Ｆ渲蠬PD-300和HPD-500型大孔樹脂對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频奈搅吭? h后的吸附量略高于其他樹脂；而AB-8型大孔樹脂對(duì)靈芝孢子粉總?cè)频奈搅扛哂谄渌麡渲?/p>
2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸附效果
8種大孔樹脂的相關(guān)物理參數(shù)及對(duì)靈芝總?cè)频撵o態(tài)吸附與解吸效果見表2。
表2 8種大孔樹脂的相關(guān)物理參數(shù)及對(duì)靈芝總?cè)频撵o態(tài)吸附與解吸效果Table 2 Physical parameters and absorption-desorption performance of eight macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum
大孔樹脂的吸附作用來源于與被吸附物質(zhì)樹脂之間的范德華力和氫鍵，兩者之間的相互作用是一個(gè)物理過程，并且其極性、比表面積、孔徑也會(huì)影響樹脂吸附和解吸。由表2可知，較大比表面積、孔徑較小、非極性的HPD-300和HPD-500型大孔樹脂對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频奈叫阅茌^好，但從解吸率和回收率考察可知HPD-500型大孔樹脂的解吸率和回收率均高于HPD-300型大孔樹脂，這可能是由于HPD-500型大孔樹脂與靈芝子實(shí)體中三萜類成分有較好的相互作用有關(guān)。對(duì)于靈芝孢子粉總?cè)贫裕鯓O性的AB-8型大孔樹脂在吸附性能、解吸率以及回收率方面均高于其他7種型號(hào)的大孔樹脂，且高于對(duì)靈芝子實(shí)體三萜的吸附、解吸效果，這可能與靈芝孢子粉三萜與子實(shí)體三萜的極性不同有關(guān)。因此，綜合靜態(tài)吸附曲線結(jié)果，選擇HPD-500型大孔樹脂為靈芝子實(shí)體總?cè)品蛛x純化的最佳樹脂，AB-8型大孔樹脂作為靈芝孢子粉總?cè)品蛛x純化的最佳樹脂。
2.4 大孔樹脂純化靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)乒に噮?shù)的確定
2.4.1 上樣液濃度的確定
靈芝子實(shí)體和孢子粉上樣液濃度對(duì)樹脂吸附性能的影響見圖3、圖4。
圖3 GLFB上樣液濃度對(duì)樹脂吸附性能的影響Fig.3 Effect of GLFB sample concentration on adsorption capability of macroporous adsorption resin
圖4 GLSP上樣液濃度對(duì)樹脂吸附性能的影響Fig.4 Effect of GLSP sample concentration on adsorption capability of macroporous adsorption resin
由圖3和圖4可知，隨上樣液濃度的增加，HPD-500型大孔樹脂對(duì)靈芝子實(shí)體中三萜類成分的吸附率在逐漸減小，但減幅較小，但隨上樣液濃度的增加，靈芝子實(shí)體的總?cè)妻D(zhuǎn)移率呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)靈芝子實(shí)體的上樣液濃度為1.0 g干樣/mL時(shí)，總?cè)妻D(zhuǎn)移率達(dá)到最大值83.72%；而AB-8型大孔樹脂對(duì)靈芝孢子粉中三萜類成分的吸附率在0.1 g干樣/mL～1.2 g干樣/mL范圍內(nèi)波動(dòng)較小，總?cè)妻D(zhuǎn)移率隨上樣液濃度增高也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但在0.4 g干樣/mL時(shí)就達(dá)到最大值87.27%。上樣液濃度較低，大孔樹脂的吸附效果不能被充分利用造成浪費(fèi)，但上樣液濃度過大會(huì)使上樣液中溶質(zhì)無法充分溶解，甚至?xí)斐蓸渲氯焕诤罄m(xù)的解吸。因此，靈芝子實(shí)體的上樣液濃度選擇1.0 g干樣/mL，而孢子粉的上樣液濃度選擇0.4 g干樣/mL。
2.4.2 上樣量的確定
HPD-500型大孔樹脂對(duì)GLFB和AB-8型大孔樹脂對(duì)GLSP吸附總?cè)频膭?dòng)態(tài)吸附曲線見圖5。
圖5 HPD-500型大孔樹脂對(duì)GLFB和AB-8型大孔樹脂對(duì)GLSP吸附總?cè)频膭?dòng)態(tài)吸附曲線Fig.5 Dynamic adsorption curves of HPD-500 for the total triterpenoids of GLFB and AB-8 for those of GLSP
由圖5可知，隨著上樣量的增加，靈芝子實(shí)體和孢子粉的流出液中總?cè)茲舛染尸F(xiàn)先平緩后快速上升趨勢(shì)。當(dāng)靈芝子實(shí)體上樣量低于2 BV時(shí)，靈芝子實(shí)體的流出液中總?cè)茲舛仍龇^小，但達(dá)到2.25 BV時(shí)，流出液中總?cè)茲舛仍龃蟮?.30 mg/mL，并隨著上樣量增大而升高；當(dāng)靈芝孢子粉上樣量低于3 BV時(shí)，流出液中總?cè)茲舛茸兓^小，但超過3 BV時(shí)，靈芝孢子粉的流出液中總?cè)茲舛妊杆僭龃蟆＿@說明靈芝子實(shí)體上樣量為2 BV，孢子粉上樣量為3 BV時(shí)，大孔吸附樹脂吸附量基本達(dá)到飽和的狀態(tài)。為避免因?yàn)檫^飽和導(dǎo)致三萜未被吸附而直接流出，從而影響分離效果，故靈芝子實(shí)體上樣量選擇2 BV，靈芝孢子粉上樣量選擇3 BV。
2.4.3 洗脫溶劑濃度的確定
經(jīng)前期試驗(yàn)確定乙醇為最適洗脫溶劑，乙醇濃度對(duì)GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊懸妶D6。
圖6 乙醇濃度對(duì)GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊慒ig.6 Effect of ethanol concentration on the elution performance of HPD-500 for GLFB and AB-8 for GLSP
由圖6可知，隨著乙醇濃度的增加，HPD-500型大孔樹脂對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频慕馕食尸F(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為75%時(shí)，對(duì)HPD-500型大孔吸附樹脂吸附的靈芝子實(shí)體總?cè)频慕馕首畲螅瑸?8.52%；而AB-8型大孔樹脂對(duì)吸附的靈芝孢子粉總?cè)频慕馕孰S著乙醇濃度的增大而逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度為95%時(shí)，對(duì)靈芝孢子粉總?cè)频慕馕蔬_(dá)到了最大，高達(dá)96.93%。這可能是由于總?cè)茷榉菢O性物質(zhì)，乙醇濃度升高降低了極性，三萜在低極性洗脫液中具有較高的溶解性，更容易被洗脫，因此選擇靈芝子實(shí)體的洗脫溶劑為75%乙醇，而孢子粉的洗脫溶劑為95%乙醇。
2.4.4 洗脫劑用量的確定
洗脫劑用量對(duì)GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊懸妶D7。
圖7 洗脫劑用量對(duì)GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊慒ig.7 Effect of eluent dosage on the elution performance of HPD-500 for GLFB and AB-8 for GLSP
由圖7可知，隨著洗脫劑用量的增加，靈芝子實(shí)體和孢子粉洗脫液中的總?cè)茲舛染氏壬吆蠼档偷内厔?shì)，且當(dāng)洗脫劑體積到達(dá)8.5 BV后，靈芝子實(shí)體和靈芝孢子粉的洗脫液中總?cè)茲舛然静辉僮兓f明8.5 BV的洗脫液就可以將總?cè)葡疵撏耆屎罄m(xù)試驗(yàn)洗脫劑用量均選擇8.5 BV。
2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)
在上述優(yōu)選的工藝條件下，采用HPD-500和AB-8型大孔樹脂分別純化靈芝子實(shí)體和孢子粉三萜粗提物，分別進(jìn)行平行試驗(yàn)3次。洗脫液濃縮、凍干至恒重后得到純化產(chǎn)物，測(cè)定純化后的靈芝子實(shí)體總?cè)坪糠謩e為60.74%、59.18%及61.85%，平均值為60.59%，孢子粉總?cè)坪糠謩e為65.43%、64.35%及66.67%，平均值為65.48%，純化效果顯著。
3 結(jié)論
靈芝中的總?cè)瓶梢酝ㄟ^大孔樹脂吸附純化，本研究以大孔樹脂對(duì)吸附率和解吸率為指標(biāo)，選用HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、HPD-826、AB-8、NKA-9、D101型8種常用的大孔樹脂分別對(duì)靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)频撵o態(tài)吸附、解吸動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察，篩選出HPD-500型大孔樹脂和AB-8型大孔樹脂分別對(duì)靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)频奈浇馕Ч詈谩Ｆ渲校琀PD-500型大孔樹脂純化靈芝子實(shí)體總?cè)频淖罴鸭兓に嚄l件：上樣液濃度為1.0 g干樣/mL，上樣量為2 BV，用8.5 BV的75%乙醇進(jìn)行洗脫。AB-8型大孔樹脂純化對(duì)靈芝孢子粉總?cè)频淖罴鸭兓に嚄l件：上樣液濃度為0.4 g干樣/mL，最大上樣量為3 BV，用8.5 BV的95%乙醇進(jìn)行洗脫。經(jīng)純化后，靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)萍兌确謩e可達(dá)到60.59%和65.48%，表明大孔樹脂能夠較好地去除雜質(zhì)，對(duì)靈芝子實(shí)體和孢子粉中總?cè)凭哂辛己玫募兓Ч且环N非常有效的分離純化方法。該大孔樹脂純化工藝的建立為靈芝子實(shí)體和孢子粉中三萜類成分的富集和后續(xù)相關(guān)原料藥制劑及保健食品的開發(fā)利用提供了新的參考依據(jù)，具有較好的應(yīng)用前景。
祝朋玲，張靜，李思雨，崔馨戈，袁抒捷，王雯，彭燦，2，3，4，5*，周俊
（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；4.安徽省中醫(yī)藥研究院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；5.省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012；6.安徽黃山云樂靈芝有限公司，安徽 宣城 242600）
靈芝（Ganoderma lucidum）是一種具有極高價(jià)值的藥食兩用的靈芝屬真菌，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，具有補(bǔ)氣安神、扶正固本、延年益壽等功效[1]，2019年已被納入“藥食同源”試點(diǎn)工作名單。靈芝孢子粉（Ganoderma lucidum spores powder，GLSP）是靈芝成熟后從真菌中排出來的橢圓形生殖細(xì)胞，包含靈芝的所有遺傳物質(zhì)[2]。靈芝子實(shí)體（Ganoderma lucidum fruiting body，GLFB）和孢子粉除可供藥用外，還可制備成各種保健食品。現(xiàn)代研究表明，靈芝子實(shí)體及孢子粉中均含有三萜類、多糖、氨基酸、甾醇、生物堿等多種活性成分[3-4]，其中三萜類化合物作為靈芝的重要活性成分之一，具有保肝護(hù)肝[5-6]、抗炎[7-8]、降血糖[9]、抗腫瘤[10]、抗氧化[11-12]、神經(jīng)保護(hù)[13]等多種藥理活性，應(yīng)用前景廣泛。
采用乙醇浸提獲得的靈芝三萜提取液中仍存有大量的雜質(zhì)，在對(duì)靈芝三萜進(jìn)行成分分析和活性研究時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的干擾作用，因此需要對(duì)靈芝三萜進(jìn)一步分離純化。到目前為止，對(duì)靈芝三萜類成分的研究多為提取工藝及藥理活性[14-16]，而鮮見針對(duì)靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)频姆蛛x純化研究。大孔樹脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，具有選擇性高、吸附能力強(qiáng)、富集效果好、再生簡(jiǎn)單、使用周期長(zhǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于三萜等天然產(chǎn)物的分離純化[17]。但目前不同型號(hào)的大孔樹脂對(duì)不同中藥中成分吸附與解吸性能不同，純化工藝也存在差異[18-20]。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，考察不同大孔樹脂分別對(duì)同源靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)拼痔崛∥锏奈脚c解吸性能，確定最佳樹脂類型，優(yōu)化分離純化靈芝總?cè)频墓に嚄l件，為靈芝三萜后續(xù)的深入研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
靈芝（Ganoderma lucidum）：安徽省旌德縣安徽黃山云樂靈芝有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為多孔菌科赤芝子實(shí)體及孢子粉。無水乙醇（分析純）：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；冰醋酸、香草醛、乙酸乙酯（均為分析純）：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；高氯酸（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度：HPLC≥98%，批號(hào)：CHB171229）：成都克洛瑪生物科技有限公司；HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、AB-8、NKA-9、D101 型大孔樹脂：北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；HPD-826型大孔樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
千分之一分析天平（BSA224S-CW）、十萬分之一分析天平（BT25S）：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋（DF-101S）：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-8000）：上海元析分析儀器有限公司；高速離心機(jī)（TG16-WS）：常州市萬豐儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-2102C）：上海智誠(chéng)分析儀器制備有限公司。
1.3 方法
1.3.1 上樣液制備
取干燥的靈芝子實(shí)體粗粉和孢子粉（干樣）各200g，分別加入無水乙醇回流提取兩次，料液比為1∶20（g/mL），每次1.5 h，溫度50℃，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，得干樣含量0.2 g/mL的儲(chǔ)備液，保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)频臐舛葴y(cè)定
1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用無水乙醇溶解，配制成0.2 mg/mL的溶液，保存?zhèn)溆谩＞芰咳?biāo)準(zhǔn)品溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、2.0、2.6 mL于10 mL試管中，于50℃烘箱中揮干乙醇，放冷，精密加入0.2 mL 50 mg/mL的香草醛冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸溶液，混勻，于70℃水浴加熱15 min，取出，冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，在548 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。以A為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得線性回歸方程：A=29.503C+0.0208，R2=0.9970，線性范圍為 4 μg/mL～104 μg/mL。
1.3.2.2 樣品中總?cè)茲舛葴y(cè)定
吸取靈芝子實(shí)體和孢子粉乙醇提取液0.1 mL，于50℃烘箱中揮干乙醇，放冷，其余步驟同1.3.2.1。根據(jù)1.3.2.1中標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算靈芝子實(shí)體和孢子粉乙醇提取液中總?cè)茲舛取?/p>
1.3.3 樹脂的預(yù)處理和含水量的測(cè)定
準(zhǔn)確稱取一定量的 HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、HPD-826、AB-8、NKA-9、D101 型大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后，倒出乙醇及漂浮物，濕法裝柱。繼續(xù)用95%乙醇沖洗樹脂柱，直至流出的乙醇洗脫液與蒸餾水（體積比為1∶1）混合無渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味，且樹脂排列均勻，備用。
取少量大孔樹脂，照2020版《中國(guó)藥典》附錄ⅨH水分測(cè)定法項(xiàng)下第一法-烘干法測(cè)定樹脂含水量。
1.3.4 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸
1.3.4.1 靜態(tài)吸附曲線的繪制
精密稱取預(yù)處理過的8種大孔樹脂，每份相當(dāng)于相應(yīng)的干樹脂2.00 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入20 mL靈芝子實(shí)體和孢子粉上樣液（相當(dāng)于0.1 g干樣/mL），每 10 min 振搖 1 次，每次 10 s，持續(xù) 2 h，并于 0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00 h吸取上清液1 mL，按1.3.2方法測(cè)定吸光度。計(jì)算不同時(shí)間各樹脂對(duì)靈芝總?cè)频奈搅浚⒗L制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。
1.3.4.2 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)
分別精密量取靈芝子實(shí)體和孢子粉上樣液10 mL（相當(dāng)于0.5 g干樣/mL）各9份，加到預(yù)處理好的各型號(hào)大孔樹脂中，靜態(tài)吸附8 h，吸取上清液1 mL，按1.3.2方法測(cè)定吸光度，計(jì)算靈芝總?cè)频臐舛取ｌo態(tài)吸附后的各型號(hào)大孔樹脂過濾后，先用適量的蒸餾水沖洗，抽干，置于250 mL具塞錐錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL于振蕩器中，振蕩12 h，過濾，95%乙醇定容至100 mL，精密量取各濾液1 mL，按1.3.2方法測(cè)定吸光度。按公式（1）～（4）計(jì)算靜態(tài)吸附量、吸附率、解吸率和回收率。
式中：Q為靜態(tài)吸附量，mg/g；C0為上樣液中總?cè)茲舛龋琺g/mL；C1為靜態(tài)吸附后上清液的總?cè)茲舛龋琺g/mL；V 為上樣液體積，mL；W 為干樹脂質(zhì)量，g；G 為吸附率，%；C3為解吸后溶液中總?cè)茲舛龋琺g/mL；D為解吸率，%；R為回收率，%。
1.3.5 大孔樹脂純化靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)乒に噧?yōu)化
1.3.5.1 上樣液濃度的選擇
準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的HPD-500和AB-8型大孔樹脂各5份（均相當(dāng)于干大孔樹脂4 g），采用濕法裝柱，HPD-500大孔樹脂柱床體積（bed volume，BV）為27 mL，AB-8型大孔樹脂柱床體積為25 mL。分別制備濃度為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0g干樣/mL 的上樣液各 10mL，以2 mL/min的流速吸附完全后，先以4 BV的水沖洗，再換用4BV的95%乙醇沖洗，收集洗脫液，測(cè)定總?cè)茲舛龋?jì)算吸附率和總?cè)妻D(zhuǎn)移率（總?cè)妻D(zhuǎn)移率/%＝洗脫液中總?cè)瀑|(zhì)量／上樣液中總?cè)瀑|(zhì)量×100），以確定最佳上樣液濃度。
1.3.5.2 上樣量的選擇
準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的HPD-500和AB-8型大孔樹脂各5份（均相當(dāng)于干大孔樹脂4 g），采用濕法裝柱。精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實(shí)體的上樣液和0.4 g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液各100 mL，以2 mL/min的流速上柱，每5 mL收集一份流出液，并測(cè)定每份流出液中的總?cè)茲舛取Ｒ粤鞒鲆悍輸?shù)為橫坐標(biāo)，流出液中總?cè)茲舛葹榭v坐標(biāo)，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線。
1.3.5.3 最適洗脫溶劑濃度的確定
精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實(shí)體的上樣液2 BV和0.4g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液3BV，以2mL/min的流速通過HPD-500和AB-8型大孔樹脂柱，分別用蒸餾水、20%、40%、50%、60%、75%、85%和95%的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫劑用量均為4 BV，分段收集洗脫液，測(cè)定總?cè)茲舛取?/p>
1.3.5.4 洗脫劑用量的考察
精密吸取1.0 g干樣/mL靈芝子實(shí)體的上樣液2 BV和0.4g干樣/mL靈芝孢子粉的上樣液3BV，以2mL/min的流速分別通過HPD-500和AB-8型大孔樹脂柱，并分別用75%乙醇、95%乙醇進(jìn)行洗脫，直至流出液無色，每5 mL接收1次流出液，每隔0.5 BV洗脫液測(cè)定其中總?cè)茲舛取?/p>
1.3.5.5 驗(yàn)證試驗(yàn)
為了考察最佳工藝條件的穩(wěn)定性，在上述篩選的最佳工藝條件下，采用HPD-500和AB-8型大孔樹脂分別純化靈芝子實(shí)體和孢子粉三萜粗提物，分別進(jìn)行平行試驗(yàn)3次。洗脫液濃縮、烘干至恒重后得到純化產(chǎn)物，按照1.3.2方法測(cè)定總?cè)坪俊?/p>
1.4 數(shù)據(jù)處理
所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin進(jìn)行圖表繪制，通過Excle軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
2 結(jié)果與分析
2.1 大孔吸附樹脂含水量
8種大孔樹脂的含水量測(cè)定結(jié)果見表1。
表1 樹脂含水量Table 1 Water content of resin
2.2 靜態(tài)吸附曲線
8種大孔樹脂對(duì)GLFB和GLSP總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線見圖1和圖2。
圖1 8種大孔樹脂對(duì)GLFB總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線Fig.1 Static adsorption curves of macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum fruiting body（GLFB）
圖2 8種大孔樹脂對(duì)GLSP總?cè)频撵o態(tài)吸附曲線Fig.2 Static adsorption curves of macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum spore powder（GLSP）
由圖1和圖2可知，0～2 h時(shí)，8種大孔樹脂對(duì)靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)频奈搅吭龃筝^快，2 h～8 h內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸平緩，說明在2 h時(shí)吸附量都已基本達(dá)到平衡，大孔樹脂對(duì)靈芝總?cè)频奈搅口呌陲柡汀Ｆ渲蠬PD-300和HPD-500型大孔樹脂對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频奈搅吭? h后的吸附量略高于其他樹脂；而AB-8型大孔樹脂對(duì)靈芝孢子粉總?cè)频奈搅扛哂谄渌麡渲?/p>
2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸附效果
8種大孔樹脂的相關(guān)物理參數(shù)及對(duì)靈芝總?cè)频撵o態(tài)吸附與解吸效果見表2。
表2 8種大孔樹脂的相關(guān)物理參數(shù)及對(duì)靈芝總?cè)频撵o態(tài)吸附與解吸效果Table 2 Physical parameters and absorption-desorption performance of eight macroporous adsorption resins for total triterpenoids of Ganoderma lucidum
大孔樹脂的吸附作用來源于與被吸附物質(zhì)樹脂之間的范德華力和氫鍵，兩者之間的相互作用是一個(gè)物理過程，并且其極性、比表面積、孔徑也會(huì)影響樹脂吸附和解吸。由表2可知，較大比表面積、孔徑較小、非極性的HPD-300和HPD-500型大孔樹脂對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频奈叫阅茌^好，但從解吸率和回收率考察可知HPD-500型大孔樹脂的解吸率和回收率均高于HPD-300型大孔樹脂，這可能是由于HPD-500型大孔樹脂與靈芝子實(shí)體中三萜類成分有較好的相互作用有關(guān)。對(duì)于靈芝孢子粉總?cè)贫裕鯓O性的AB-8型大孔樹脂在吸附性能、解吸率以及回收率方面均高于其他7種型號(hào)的大孔樹脂，且高于對(duì)靈芝子實(shí)體三萜的吸附、解吸效果，這可能與靈芝孢子粉三萜與子實(shí)體三萜的極性不同有關(guān)。因此，綜合靜態(tài)吸附曲線結(jié)果，選擇HPD-500型大孔樹脂為靈芝子實(shí)體總?cè)品蛛x純化的最佳樹脂，AB-8型大孔樹脂作為靈芝孢子粉總?cè)品蛛x純化的最佳樹脂。
2.4 大孔樹脂純化靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)乒に噮?shù)的確定
2.4.1 上樣液濃度的確定
靈芝子實(shí)體和孢子粉上樣液濃度對(duì)樹脂吸附性能的影響見圖3、圖4。
圖3 GLFB上樣液濃度對(duì)樹脂吸附性能的影響Fig.3 Effect of GLFB sample concentration on adsorption capability of macroporous adsorption resin
圖4 GLSP上樣液濃度對(duì)樹脂吸附性能的影響Fig.4 Effect of GLSP sample concentration on adsorption capability of macroporous adsorption resin
由圖3和圖4可知，隨上樣液濃度的增加，HPD-500型大孔樹脂對(duì)靈芝子實(shí)體中三萜類成分的吸附率在逐漸減小，但減幅較小，但隨上樣液濃度的增加，靈芝子實(shí)體的總?cè)妻D(zhuǎn)移率呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)靈芝子實(shí)體的上樣液濃度為1.0 g干樣/mL時(shí)，總?cè)妻D(zhuǎn)移率達(dá)到最大值83.72%；而AB-8型大孔樹脂對(duì)靈芝孢子粉中三萜類成分的吸附率在0.1 g干樣/mL～1.2 g干樣/mL范圍內(nèi)波動(dòng)較小，總?cè)妻D(zhuǎn)移率隨上樣液濃度增高也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但在0.4 g干樣/mL時(shí)就達(dá)到最大值87.27%。上樣液濃度較低，大孔樹脂的吸附效果不能被充分利用造成浪費(fèi)，但上樣液濃度過大會(huì)使上樣液中溶質(zhì)無法充分溶解，甚至?xí)斐蓸渲氯焕诤罄m(xù)的解吸。因此，靈芝子實(shí)體的上樣液濃度選擇1.0 g干樣/mL，而孢子粉的上樣液濃度選擇0.4 g干樣/mL。
2.4.2 上樣量的確定
HPD-500型大孔樹脂對(duì)GLFB和AB-8型大孔樹脂對(duì)GLSP吸附總?cè)频膭?dòng)態(tài)吸附曲線見圖5。
圖5 HPD-500型大孔樹脂對(duì)GLFB和AB-8型大孔樹脂對(duì)GLSP吸附總?cè)频膭?dòng)態(tài)吸附曲線Fig.5 Dynamic adsorption curves of HPD-500 for the total triterpenoids of GLFB and AB-8 for those of GLSP
由圖5可知，隨著上樣量的增加，靈芝子實(shí)體和孢子粉的流出液中總?cè)茲舛染尸F(xiàn)先平緩后快速上升趨勢(shì)。當(dāng)靈芝子實(shí)體上樣量低于2 BV時(shí)，靈芝子實(shí)體的流出液中總?cè)茲舛仍龇^小，但達(dá)到2.25 BV時(shí)，流出液中總?cè)茲舛仍龃蟮?.30 mg/mL，并隨著上樣量增大而升高；當(dāng)靈芝孢子粉上樣量低于3 BV時(shí)，流出液中總?cè)茲舛茸兓^小，但超過3 BV時(shí)，靈芝孢子粉的流出液中總?cè)茲舛妊杆僭龃蟆＿@說明靈芝子實(shí)體上樣量為2 BV，孢子粉上樣量為3 BV時(shí)，大孔吸附樹脂吸附量基本達(dá)到飽和的狀態(tài)。為避免因?yàn)檫^飽和導(dǎo)致三萜未被吸附而直接流出，從而影響分離效果，故靈芝子實(shí)體上樣量選擇2 BV，靈芝孢子粉上樣量選擇3 BV。
2.4.3 洗脫溶劑濃度的確定
經(jīng)前期試驗(yàn)確定乙醇為最適洗脫溶劑，乙醇濃度對(duì)GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊懸妶D6。
圖6 乙醇濃度對(duì)GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊慒ig.6 Effect of ethanol concentration on the elution performance of HPD-500 for GLFB and AB-8 for GLSP
由圖6可知，隨著乙醇濃度的增加，HPD-500型大孔樹脂對(duì)靈芝子實(shí)體總?cè)频慕馕食尸F(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為75%時(shí)，對(duì)HPD-500型大孔吸附樹脂吸附的靈芝子實(shí)體總?cè)频慕馕首畲螅瑸?8.52%；而AB-8型大孔樹脂對(duì)吸附的靈芝孢子粉總?cè)频慕馕孰S著乙醇濃度的增大而逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度為95%時(shí)，對(duì)靈芝孢子粉總?cè)频慕馕蔬_(dá)到了最大，高達(dá)96.93%。這可能是由于總?cè)茷榉菢O性物質(zhì)，乙醇濃度升高降低了極性，三萜在低極性洗脫液中具有較高的溶解性，更容易被洗脫，因此選擇靈芝子實(shí)體的洗脫溶劑為75%乙醇，而孢子粉的洗脫溶劑為95%乙醇。
2.4.4 洗脫劑用量的確定
洗脫劑用量對(duì)GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊懸妶D7。
圖7 洗脫劑用量對(duì)GLFB和GLSP總?cè)葡疵撔Ч挠绊慒ig.7 Effect of eluent dosage on the elution performance of HPD-500 for GLFB and AB-8 for GLSP
由圖7可知，隨著洗脫劑用量的增加，靈芝子實(shí)體和孢子粉洗脫液中的總?cè)茲舛染氏壬吆蠼档偷内厔?shì)，且當(dāng)洗脫劑體積到達(dá)8.5 BV后，靈芝子實(shí)體和靈芝孢子粉的洗脫液中總?cè)茲舛然静辉僮兓f明8.5 BV的洗脫液就可以將總?cè)葡疵撏耆屎罄m(xù)試驗(yàn)洗脫劑用量均選擇8.5 BV。
2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)
在上述優(yōu)選的工藝條件下，采用HPD-500和AB-8型大孔樹脂分別純化靈芝子實(shí)體和孢子粉三萜粗提物，分別進(jìn)行平行試驗(yàn)3次。洗脫液濃縮、凍干至恒重后得到純化產(chǎn)物，測(cè)定純化后的靈芝子實(shí)體總?cè)坪糠謩e為60.74%、59.18%及61.85%，平均值為60.59%，孢子粉總?cè)坪糠謩e為65.43%、64.35%及66.67%，平均值為65.48%，純化效果顯著。
3 結(jié)論
靈芝中的總?cè)瓶梢酝ㄟ^大孔樹脂吸附純化，本研究以大孔樹脂對(duì)吸附率和解吸率為指標(biāo)，選用HPD-100、HPD-300、HPD-500、HPD-750、HPD-826、AB-8、NKA-9、D101型8種常用的大孔樹脂分別對(duì)靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)频撵o態(tài)吸附、解吸動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察，篩選出HPD-500型大孔樹脂和AB-8型大孔樹脂分別對(duì)靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)频奈浇馕Ч詈谩Ｆ渲校琀PD-500型大孔樹脂純化靈芝子實(shí)體總?cè)频淖罴鸭兓に嚄l件：上樣液濃度為1.0 g干樣/mL，上樣量為2 BV，用8.5 BV的75%乙醇進(jìn)行洗脫。AB-8型大孔樹脂純化對(duì)靈芝孢子粉總?cè)频淖罴鸭兓に嚄l件：上樣液濃度為0.4 g干樣/mL，最大上樣量為3 BV，用8.5 BV的95%乙醇進(jìn)行洗脫。經(jīng)純化后，靈芝子實(shí)體和孢子粉總?cè)萍兌确謩e可達(dá)到60.59%和65.48%，表明大孔樹脂能夠較好地去除雜質(zhì)，對(duì)靈芝子實(shí)體和孢子粉中總?cè)凭哂辛己玫募兓Ч且环N非常有效的分離純化方法。該大孔樹脂純化工藝的建立為靈芝子實(shí)體和孢子粉中三萜類成分的富集和后續(xù)相關(guān)原料藥制劑及保健食品的開發(fā)利用提供了新的參考依據(jù)，具有較好的應(yīng)用前景。
