超聲波輔助脫脂鴿骨粉的制備及營養成分測定

高昕悅，力俊琛，王雪，巴吐爾·阿不力克木

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

骨粉是指動物去除肉、內臟或不宜食用的下腳料，經高溫高壓蒸煮、脫脂、冷凍、干燥、粉碎后得到的產品[1]。近年來，骨粉的研究愈加深入[2-3]，對骨頭進行高程度加工利用，可制備骨粉、骨泥、骨蛋白、軟骨素、骨油、骨碳等，不僅可作為食品營養強化劑，減少環境的污染，又可提高骨資源綜合利用[4-7]。

鴿肉中營養成分較為豐富。隨著鴿業產業的發展，市面上鴿肉產品逐漸增多，肉鴿的副產物鴿骨也隨之增加。相關研究證明一般鴿骨約占活鴿體重的20%左右，含有大量的鈣、磷和人體所必需的氨基酸等營養成分[8-10]，其中鈣含量是磷含量的2倍，其含量比是人體吸收的最佳比例。近些年來，有關乳鴿的研究逐漸深入，相玉秀等[11]以乳鴿為原料，通過正交試驗方法研究陳皮綠豆乳鴿湯制作方法；趙永敢等[12]通過高溫高壓抽提法研究鴿骨中營養物質；姚宏亮等[13]利用不同酶對乳鴿胸脯肉進行酶解，研究水解后鴿肉酶解液的體外抗氧化性。但關于鴿骨的加工利用文獻較少，因此，本試驗選取除頭部、爪部外軀干部位鴿骨作為原料，利用超聲波輔助溶劑法[14-15]，通過響應面試驗法進行參數優化，制備得到無異味的脫脂鴿骨粉，對比鴿骨粉脫脂前后營養成分的變化，可以將其作為食品營養添加劑，增加鴿骨的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉鴿：市售，品種為塔里木肉鴿，經水煮去肉選取去除頭部、爪部、外軀干部位鴿骨，冷凍保存待用；石油醚、醋酸乙酯、異丙醇（均為分析純）：天津市鑫鉑特化工有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-250DE超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；2XZ-2真空冷凍干燥機：上海豫明儀器有限公司；FW-10高速粉碎機：北京市永光明醫療儀器有限公司；DHG-9123A鼓風干燥機：上海一恒科技有限公司；1100型高效液相色譜儀、5900型等離子發射光譜儀：常州市偉嘉儀器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 鴿骨樣品制備

樣品制備工藝：乳鴿預處理→煮制→脫骨→超聲波輔助溶劑脫脂→一次冷凍（-20℃、24 h）→二次冷凍（-40℃、4 h）→真空冷凍干燥→高速粉碎→成品→低溫貯藏。

操作要點：將白條肉鴿置于高壓鍋中水煮后去肉脫骨，通過超聲波法對鴿骨進行脫脂處理；將脫脂后的鴿骨置于鼓風干燥箱內通風干燥3 h；溶劑揮發后鴿骨置于-20℃下一次冷凍24 h，放入超低溫冰箱二次冷凍4 h；真空冷凍去除水分并利用高速粉碎機粉碎鴿骨至140目無殘留。

1.3.2 脫脂劑篩選試驗

采用秦曉潔等[16]牦牛骨粉制備方法以及許晶冰等[17]脫脂兔骨粉制備方法進行鴿骨脫脂并稍作修改。結合超聲波輔助溶劑脫脂法，對熱水、醋酸乙酯、異丙醇、無水乙醇4種不同脫脂劑進行篩選。前期試驗篩選出最佳脫脂溶劑參數為超聲時間30 min、超聲功率200 W、液料比為2 mL/g，對比4種不同溶劑對鴿骨脫脂率的影響，測定脫脂前后鴿骨中的脂肪含量，通過計算脫脂率確定最佳脫脂劑。脫脂率計算公式如下。

脫脂率/%=（Wa-Wb）/Wa×100

式中：Wa為脫脂前脂肪含量，%；Wb為脫脂后脂肪含量，%。

1.3.3 單因素試驗設計

在超聲溫度35℃的條件下各因素參數固定為超聲功率200 W、超聲時間30 min、液料比3 mL/g。各個因素梯度設置為超聲功率 150、175、200、225、250 W，超聲時間 20、30、40、50、60 min，液料比 2、4、6、8、10 mL/g。以鴿骨脫脂率為評價指標，各因素試驗重復3次，測定結果取平均值。

1.3.4 響應面試驗設計

結合單因素試驗結果，以超聲時間（A）、超聲功率（B）、液料比（C）作為自變量，脫脂率（Y1）作為響應值，試驗設計見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 指標測定

色澤：采用色差計法測定脫脂前后鴿骨粉的色澤[18]。

水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中直接干燥法[19]測定。

脂肪含量：參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》[20]中索氏提取法測定。

氨基酸：參照GB 5009.124—2016[21]《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》中方法測定脫脂前后鴿骨粉的氨基酸種類及含量。

Ca、P 含量：參照 GB 5009.92—2016《食品安全國家標準食品中鈣的測定》中鈣測定方法[22]和GB 5009.87—2016《食品安全國家標準食品中磷的測定》中磷測定方法[23]測定脫脂前后鴿骨粉的鈣、磷含量。

1.4 處理數據

采用SPSS和Graphpad方法進行數據分析與作圖，結果用平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 鴿骨脫脂溶劑的篩選

選取醋酸乙酯、無水乙醇、異丙醇、熱水作為脫脂溶劑，篩選出脫脂效果最佳的脫脂劑。各脫脂劑的脫脂效果如圖1所示。

圖1 不同脫脂劑對鴿骨脫脂率的影響Fig.1 Effect of defatting solvents on defatting rate of pigeon bone

由圖1可知，不同脫脂劑對鴿骨的脫脂效果有所差異，熱水、醋酸乙酯、無水乙醇的脫脂率分別為14.5%、20.65%、17.5%，異丙醇的脫脂率高達72.9%，說明不同脫脂劑對鴿骨的脫脂效果差異顯著（P＜0.05），異丙醇的脫脂率是醋酸乙酯組的3.0倍，這是由于異丙醇具有良好的溶解性、揮發性，且其沸點低、毒性小，是一種易于回收的溶劑。因此，最終選取最佳脫脂劑為異丙醇。

2.2 超聲波處理條件對鴿骨脫脂率的影響

不同超聲時間對鴿骨脫脂率的影響見圖2。

圖2 不同超聲時間對鴿骨脫脂率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on defatting rate of pigeon bone

由圖2可知，鴿骨粉的脫脂率受超聲時間的影響較為明顯，隨超聲時間不斷延長，脫脂率呈現先升高后降低的趨勢，當超聲時間為40 min時，脫脂率達到最大值，為72.84%。這可能是由于超聲波產生的次級效應導致異丙醇發生乳化現象[24]，并隨著超聲時間增加而滲透于鴿骨內部，加速油脂的溶出，首先溶出的是鴿骨組織間細胞外的油脂，之后由于超聲波空化作用，油脂細胞破損，在超聲波輔助溶劑的作用下，組織細胞內的油脂向外部轉移到脫脂溶劑中[25]。當超聲時間增加到 50、60 min 時，脫脂率差異不顯著（P＞0.05），脫脂效果變化緩慢，這一現象的產生可能是由于超聲時間不斷延長，超聲波產生的超聲效應由鴿骨表面至鴿骨內，隨著脫脂溶劑不斷深入組織內部，超聲波效應與脫脂溶劑達到高度飽和，從而降低提取效率，繼續延長超聲時間鴿骨脫脂效果無明顯變化。最終確定超聲波處理時間為40 min進行后續試驗。

不同超聲功率對鴿骨脫脂率的影響見圖3。

圖3 不同超聲功率對鴿骨脫脂率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on defatting rate of pigeon bone

由圖3可知，隨超聲功率不斷增加，脫脂率先升高后降低。當超聲功率為225 W時，脫脂率達到最大值，為67.91%，可能是由于超聲波具有一定能量性和波動性，可以促進分子的擴散速率，同時超聲波輔助脫脂溶劑可以加大鴿骨油脂溶出的速度。當超聲功率為175、200 W時，脫脂率分別為35.81%、40.75%，差異不顯著（P＞0.05），其原因可能是超聲功率強度較弱，導致脫脂溶劑滲透到鴿骨組織內部速率緩慢，但當超聲功率提高至250 W時脫脂率急劇下降，這與陳麗清等[26]研究結果相一致，可能存在過高的超聲波次級效應使脫脂溶劑產生自由基，局部溫度瞬時升高，導致鴿骨中油脂組織被破壞，脫脂速率急劇下降。最終試驗結果表明，超聲功率為225 W可達到較好的脫脂效果。

不同液料比對鴿骨脫脂率的影響見圖4。

圖4 不同液料比對鴿骨脫脂率的影響Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on defatting rate of pigeon bone

由圖4可知，在超聲溫度固定為35℃條件下，液料比的添加量與鴿骨脫脂率呈現正相關趨勢，當液料比為10 mL/g時，脫脂率為72.84%，達到最大值，但當液料比為8 mL/g時，脫脂率為70.37%，兩者相差為2.47%，差異不顯著（P＞0.05）。其原因可能是對于一定質量的鴿骨，異丙醇的用量與溶劑中油脂濃度呈相反的作用，增加鴿骨與脫脂溶劑接觸表面的濃度差，能夠促使傳質推動力的增加，當液料比增加到一定程度時，脫脂溶劑會不斷滲透到鴿骨內部使得油脂浸出，最終達到一定飽和程度時，油脂溶出速率漸緩[27-30]。因此從經濟與環保的角度考慮，最終選取液料比為8 mL/g。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 回歸模型建立與方差分析

脫脂鴿骨粉制備的響應面試驗優化結果如表2所示。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface methodology results

對試驗結果進行多元回歸擬合，得到脫脂率對自變量的二次多元回歸方程Y1=69.39+1.58A+1.53B+0.562 5C-0.9450AB-1.85AC+0.012 5BC-5.98A2-7.29B2-4.76C2。

根據以上回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表3 方差結果分析Table 3 Analysis of variance results

由表3可知，脫脂率的回歸模型F值為40.25，P＜0.000 1，極顯著。失擬項P＞0.05，不顯著。模型的決定系數（R2=0.981 0）與校正系數（RAdj2=0.956 7）有著高度擬合性，模型一次項A對脫脂率的影響極顯著，二次項A2、B2、C2對脫脂率的影響均極顯著。最終，由F值可知3個因素對脫脂鴿骨粉脫脂率的影響大小依次為A＞B＞C。

2.3.2 響應面與等高線分析

各因素之間的交互作用對脫脂率影響的響應面與等高線圖見圖5～圖7。

圖5 超聲功率與超聲時間交互作用的響應面與等高線分析Fig.5 Response surface and contour analysis of the interaction between ultrasonic power and ultrasonic time

圖6 液料比與超聲時間交互作用的響應面與等高線分析Fig.6 Response surface and contour analysis of the interaction between liquid-to-solid ratio and ultrasonic time

圖7 液料比與超聲功率交互作用的響應面與等高線分析Fig.7 Response surface and contour analysis of the interaction between liquid-to-solid ratio and ultrasonic power

從圖5～圖7中可以看出，每個因素之間的顯著性可以直觀地表現在響應面圖中。橢圓形等高線表示各因素之間存在顯著交互作用，而圓形等高線表示相互作用不顯著。從響應面圖可以得出，超聲時間、超聲功率、液料比對鴿骨粉的脫脂率存在影響，影響大小為超聲功率（A）＞超聲時間（B）＞液料比（C），此結果與方差分析結果一致。

為判定響應面優化后得到的方程是否具有實踐指導意義，需進行驗證試驗。利用Design-Expert軟件預測得到最佳工藝參數：超聲時間為41.19 min、超聲功率為227.43 W、液料比為8.04 mL/g，在此條件下的脫脂率為69.59%。結合實際的試驗，調整最佳參數為超聲時間40 min、超聲功率225 W、液料比8 mL/g。為了確定最終模型的可靠性，以調整最佳參數進行驗證試驗，脫脂率為70.63%，與預測值相差1.04%。因此通過響應面設計的脫脂鴿骨粉工藝參數準確可行，具有一定的實踐指導意義。

2.4 脫脂前后鴿骨粉色澤及營養成分變化

脫脂前后鴿骨粉色澤及營養成分變化見表4。

表4 脫脂前后色澤及營養成分變化Table 4 Changes in color and nutritional composition before and after defatting

由表4可知，脫脂后的L*值增加，a*值和b*值降低。脫脂后鴿骨粉顏色由棕褐色變為灰白色，顏色變淺，說明脫脂處理對骨粉色澤影響較大。鴿骨粉脫脂前脂肪含量高達13%，脫脂后骨粉脂肪含量顯著降低，未脫脂的骨粉不僅不利于鴿骨的粉碎，而且還會導致產品極易氧化酸敗[31]，嚴重影響鴿骨粉品質，所以脫脂處理是研制骨粉的關鍵步驟之一。骨粉中鈣、磷含量較為豐富，脫脂前后鈣含量是磷含量的近2倍，是人體吸收鈣、磷的最佳比例，可以作為食品營養強化劑添加。脫脂前后的骨粉均采用真空冷凍干燥除去水分，但最終水分含量存在一定變化，這可能是由于未脫脂的骨粉存在較多的油脂，油脂會包裹在鴿骨表面，影響水分的蒸發[32]。相反，脫脂后的骨粉，由于脂肪含量較低，通過真空冷凍干燥可以有效降低其內部水分。

脫脂前后鴿骨粉氨基酸種類及含量見表5。

表5 脫脂前后鴿骨粉氨基酸種類及含量Table 5 Amino acid types and content of pigeon bone meal before and after defatting %

由表5可知，脫脂前后鴿骨粉的氨基酸含量發生了變化，但種類不變。通過顯著性分析得出，脫脂處理對氨基酸的含量均存在顯著性影響，脯氨酸在脫脂后呈現增加的趨勢，這可能是由于骨粉中的脂質被大部分脫除，脯氨酸含量增加，這也進一步提高了鴿骨粉的蛋白質品質[33]。脫脂前后鴿骨粉氨基酸共有16種，其中人體必需氨基酸有9種，分別是Lys、His、Phe、Met、Thr、Ile、Leu、Val、Arg；非必需氨基酸有 7 種，分別是 Glu、Ala、Gly、Asp、Pro、Ser和 Tyr。鴿骨粉脫脂前后必需氨基酸中苯丙氨酸含量最高，苯丙氨酸可以添加到焙烤食品中，有增強苯丙氨酸營養價值的作用，并且可以與糖類發生氨基-羧化反應，具有提高風味的作用。非必需氨基酸中甘氨酸和脯氨酸含量較高，在很多動物性食品中，甘氨酸作為添加劑、防腐劑使用[34-35]，脯氨酸具有分解蛋白質的重要作用，可幫助人體形成新的細胞，并且脯氨酸和賴氨酸都是生產羥脯氨酸和羥賴氨酸所需要的，可構建膠原蛋白。

3 結論

本試驗利用超聲波輔助溶劑法對鴿骨進行脫脂處理，選取最佳脫脂溶劑后分別研究超聲時間、超聲功率、液料比對鴿骨脫脂率的影響，以單因素試驗結果為基礎，進行響應面試驗設計。結果表明：最優脫脂劑為異丙醇，在單因素試驗基礎上，通過響應面試驗優化得最佳條件為超聲時間40 min，超聲功率225 W，液料比為8 mL/g，此時，脫脂率為69.39%，脫脂后的營養成分發生變化，色澤發生明顯改善，鈣、磷含量有所增加，氨基酸含量降低但種類不變。