冠突散囊菌發酵鮮桑葉對其黃酮抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響

劉瑾如，邱衛華

（1.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190；2.中國農業大學工學院農業工程系，北京 100083）

近年來，全球范圍內糖尿病的發病率逐年增高，預計到2045年，全球將會有近七億糖尿病患者[1]。我國的糖尿病患者人數居世界首位，其中90%～95%為II型糖尿病[2-4]。α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過抑制糖苷酶活性降低和延緩餐后血糖的上升，并且能有效延緩糖尿病前期患者向II型糖尿病的發展[5]。目前臨床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物主要是阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等。但是這些藥物普遍會產生一些副作用，如低血糖、水腫、乳酸中毒、胃腸道不耐受，甚至對肝臟的不良影響等[6-7]。因此，開發新型多靶點、安全價廉、高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究的熱點[8]。

桑葉在我國分布廣泛，含有黃酮類、生物堿類、多糖類、氨基酸類等多種生物活性物質，是典型的藥食兩用資源[9-10]。作為桑葉的主要功能成分之一，黃酮類物質是桑葉發揮降血糖、降血壓、抗氧化、抗衰老等作用的主要成分[11-13]。近年來，國內外開展了大量桑葉黃酮（mulberry leaf flavonoids，MLF）對 II型糖尿病治療作用的研究，并發現MLF具有抑制α-葡萄糖苷酶活性、降低胰島素抵抗、增加葡萄糖消耗和骨骼肌線粒體功能等作用[14-17]。因此，MLF在糖尿病治療中具有廣闊的應用前景。但是，現有桑葉的研究大都是基于干制品開展的。在干燥過程中，黃酮等熱敏性活性物質的含量和活性都會有不同程度損失。多部醫藥古籍中也有關于“生者優良”的觀點，即在新鮮狀態下可以更好地保持植物中活性成分的活性和功效[18-19]。因此，開展新鮮桑葉的相關研究有助于拓寬桑葉的應用前景。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）亦稱之為“金花”，是屬于散囊菌目發菌科散囊菌屬的一種無毒且安全的益生真菌，已被廣泛應用于福磚黑茶[20]、沙棘葉[21]、紅豆[22]等的生物和風味化合物的形成或轉化中。據報道它在植物的發酵過程中可分泌包括α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、纖維素酶、蛋白酶等多種酶。這些酶不僅可以促進原料中易發酵物質的降解，增加植物中活性成分的含量，還可以改善活性成分的功能[23-24]。目前已有許多關于冠突散囊菌發酵提高原料中總黃酮含量的報道，包括桑葉、銀杏葉、葛根、黑豆等[24-27]。因此，本文以自行篩選得到的冠突散囊菌E.cristatum CY-1進行鮮桑葉的固態發酵，研究了發酵對桑葉黃酮的含量及其對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，以期達到通過微生物發酵實現桑葉中黃酮物質的富集，并提高其抗血糖功效的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冠突散囊菌E.cristatum CY-1：中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室自行篩選得到；鮮桑葉：市售；α-葡萄糖苷酶（酵母來源）、蘆丁標準品（純度≥98%）、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，純度≥99%）、氨基葡萄糖標準溶液（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；二硝基水楊酸、乙酰丙酮、對二氨基苯甲醛、亞硝酸鈉、硝酸鋁、NaOH、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MB-96B型酶標分析儀：蘇州聘懷科技有限公司；H2050R-1型高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；754PC型紫外-可見分光光度計：上海菁華科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌E.cristatum CY-1的固態發酵

土豆汁-葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養基的制備：稱取200 g馬鈴薯，去皮切碎，加水煮20 min后，紗布過濾取土豆汁，加入20 g葡萄糖，定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min，冷卻后備用。

E.cristatum CY-1種子液的制備：接種E.cristatum CY-1孢子于無菌的土豆汁-葡萄糖液體培養基中，在28℃～30℃以 180 r/min～200 r/min振蕩培養 2 d～3 d，得到冠突散囊菌種子液。

桑葉發酵培養基的制備：稱取洗凈瀝干水分的鮮桑葉500 g，分批加入到植物攪碎機中，加入適量蒸餾水進行攪碎，最終蒸餾水的加入體積為100 mL。收集攪碎后的鮮桑葉。按照與鮮桑葉質量比1∶10加入麩皮，自然pH值下攪拌均勻，得到桑葉固態發酵培養基。在250 mL三角瓶中加入上述30 g桑葉固態發酵培養基質，于121℃滅菌20 min后，冷卻，用于E.cristatum CY-1的固態發酵。以10%接種量接種E.cristatum CY-1種子液，攪拌均勻后，置于28℃～30℃培養箱中靜置培養。每2 d取樣，樣品置于4℃冰箱冷藏備用。每組試驗設置3個平行。

1.3.2 冠突散囊菌生物量的測定

桑葉固態發酵基質中冠突散囊菌生物量的測定采用氨基葡萄糖法[28]。首先在520 nm測定氨基葡萄糖標準品含量與吸光度的關系，并建立其標準曲線。以E.cristatum CY-1純菌體進行氨基葡萄糖的提取，在520 nm測定該提取液的吸光度，根據上述氨基葡萄糖標準品含量與吸光度的標準曲線得出提取液中所含氨基葡萄糖的量，并建立E.cristatum CY-1中氨基葡萄糖含量與其生物量的標準曲線。經E.cristatum CY-1固態發酵的桑葉培養物在60℃烘干至恒重后用于氨基葡萄糖的提取與測定，根據標準曲線方程（1）計算提取液中氨基葡萄糖含量，再根據標準曲線方程（2）換算得到發酵基質中E.cristatum CY-1的生物量。

式中：Y0為提取液中氨基葡萄糖的含量，mg；X0為提取液中氨基葡萄糖的吸光度；Y1為換算得到的菌體生物量，mg。

E.cristatum CY-1純菌體的制備方法：將E.cristatum CY-1接種至土豆汁-葡萄糖液體培養基，在28℃～30℃以180 r/min～200 r/min振蕩培養7 d。以紗布過濾發酵產物，并以蒸餾水充分洗滌，收集固體剩余物，烘干至恒重即得E.cristatum CY-1純菌體。

1.3.3 冠突散囊菌發酵過程中桑葉基質失重率分析

取適量經E.cristatum CY-1固態發酵的剩余物，在60℃干燥至恒重后，按式（3）計算其含水率（%）。然后按式（4）計算發酵前后桑葉基質的失重率。

式中：R1和R2分別為發酵剩余物干燥前與干燥后的質量，g。

式中：W0和Wt分別為發酵前鮮桑葉基質和不同發酵時間桑葉基質的質量，g；R0和Rt分別為發酵前鮮桑葉基質和不同發酵時間桑葉基質的含水率，%。

1.3.4 桑葉總黃酮與總多糖的提取及其含量的測定

桑葉總多糖的提取及測定[29]：稱取發酵前后的桑葉樣品（濕重），按照料液比 1∶30（g/mL）加入蒸餾水，混勻后于80℃水浴超聲輔助提取20 min，抽濾收集桑葉總多糖提取液。該多糖提取液以6 mol/L鹽酸于沸水浴中水解30 min，冷卻后調節pH值至8.0，得到桑葉多糖水解液。以葡萄糖為標準品，采用二硝基水楊酸法測定該水解液中還原糖含量（mg/g干桑葉）。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，故在計算單糖含量時需乘以0.9計算桑葉中總多糖含量。

桑葉總黃酮的提取及測定[30]：稱取發酵前后的桑葉樣品（濕重），按照料液比1∶10（g/mL）加入70%的乙醇溶液，50℃水浴超聲輔助提取40 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液。沉淀物再按上述步驟重復提取1次，合并上清液，即得桑葉總黃酮提取液。以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-NaOH比色法于510 nm處測定吸光度，根據標準曲線方程Y=13.09X-0.057 7（R2=0.991 3）計算桑葉黃酮提取液中總黃酮含量（mg/g干桑葉）。

1.3.5 ɑ-葡萄糖苷酶抑制率分析

桑葉黃酮對ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率分析在96孔板上進行[31-32]。共設置4個組別：空白組、對照組、樣品空白組、樣品組。其中，對照組為ɑ-葡萄糖苷酶與底物pNPG反應組；樣品組中加入以pH6.8磷酸緩沖液（0.2 mol/L）稀釋至0.001 mg/mL～0.040 mg/mL的桑葉黃酮提取物作為抑制劑。每個試驗組所加入的試劑及添加順序如表1所示。在反應結束時，加入1 mol/L Na2CO3溶液終止反應，然后于405 nm波長下，以酶標分析儀測定吸光度。

表1 不同試驗組中各反應物添加量和順序Table 1 The adding volume and order of reagents in different experimental group μL

根據試驗結果，按式（5）計算抑制劑對ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率。并對經E.cristatumCY-1固態發酵4、8d和10d所得的桑葉的黃酮提取物進行濃度（0.001 mg/mL～0.040 mg/mL）與ɑ-葡萄糖苷酶抑制率（%）的非線性擬合，根據擬合曲線計算半抑制劑濃度（IC50）。

式中：AB為pNPG自動分解得到的吸光度；AC為pNPG自動分解和酶促分解得到的吸光度和；ASB為樣品和pNPG自動分解得到的吸光度和；AS為樣品、pNPG自動分解、酶促分解及抑制劑抑制分解所得到的吸光度總和。

1.4 數據統計分析

所有結果數據都設立至少3個平行組。采用Origin 9.0進行數據處理及圖形繪制。采用One-way ANOVA進行數據的統計學分析，在95%置信區間被認為具有統計學意義（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 E.cristatum CY-1桑葉固態發酵的細胞生長及桑葉基質失重率

采用E.cristatum CY-1進行桑葉固態發酵，發酵過程中E.cristatum CY-1的細胞生長及桑葉基質的失重率見圖1。

圖1 以鮮桑葉為基質的冠突散囊菌細胞生長曲線及桑葉基質失重率Fig.1 The cell growth curve of E.cristatum CY-1 using mulberry leaves as substrate and the weight loss of mulberry leaf medium

由圖1可知，就細胞生長而言，以ML固態發酵細胞干重隨著發酵時間的延長而增加，且生長情況要優于以PDB液態發酵。在E.cristatum CY-1固態發酵桑葉基質的第8天，生物量達到最高值，為378.2 mg，之后生長趨于穩定。而隨著E.cristatum CY-1的生長，桑葉培養基的失重率也增加，在發酵進行到第8天時，桑葉培養基的失重率達到19.64%，之后趨于穩定，這和E.cristatum CY-1的生長曲線趨勢是一致的。

2.2 發酵過程中桑葉總黃酮含量的變化

桑葉總黃酮含量隨E.cristatum CY-1發酵的變化見圖2。

圖2 桑葉總黃酮含量隨E.cristatum CY-1發酵的變化Fig.2 The total flavonoids content in mulberry leaves during the fermentation of E.cristatum CY-1

通過研究E.cristatum CY-1固態發酵對桑葉總黃酮含量的影響發現，發酵后桑葉總黃酮的含量隨著發酵時間的延長而不斷增加，在第8天達到峰值3.289mg/g干桑葉，相對于未經發酵桑葉中總黃酮的含量提高了78.72%（圖2）。總黃酮含量的升高主要歸因于冠突散囊菌發酵過程中分泌的多種酶，如苯丙氨酸解氨酶、纖維素酶等均可破壞細胞壁的致密結構、降低細胞壁對黃酮類化合物溶出的阻滯作用，從而增加了總黃酮類物質的含量[27]。另一方面，通過分析發酵基質中總多糖含量的變化發現，雖然在發酵0～2 d，總多糖含量出現短暫的升高，但此后，隨著發酵的進行總多糖含量快速降低，在第10天時基質中的總多糖含量由第2天的165.71 mg/g干桑葉降低至39.44 mg/g干桑葉，降解率達到79.52%。這說明基質中易發酵的多糖類物質作為營養源被E.cristatum CY-1用于維持生長與代謝。而隨著多糖等物質的降解，發酵剩余物中黃酮類物質的相對含量顯著提高[27，33]。另外，發酵過程中微生物可能通過生物轉化促進黃酮類物質的生成，如申春莉等[34]發現在靈芝菌發酵豆渣的發酵前期，豆渣中的糖苷型異黃酮轉化為苷元型異黃酮，這也可能造成發酵桑葉中黃酮類物質含量升高。

但是，發酵8 d后桑葉發酵剩余物中總黃酮含量迅速降低，在發酵第10天黃酮含量降至1.725 mg/g干桑葉，相對于第8天減少了約47.6%。造成發酵桑葉中總黃酮含量減少的原因，一方面是由于微生物發酵過程中分泌的次級代謝產物可與黃酮類化合物發生反應，導致黃酮類化合物的減少[34]。另一方面，在發酵后期，隨著可發酵營養物質的消耗，黃酮類化合物可被微生物分泌的酶降解，并作為營養基質參與微生物的生長及代謝，從而造成黃酮含量的降低[33]。

2.3 發酵對桑葉中總黃酮α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

許多研究發現E.cristatum具有提高底物營養價值和生物活性的巨大潛力，如E.cristatum可以增強黑豆發酵過程中酚類化合物積累的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性[24]，E.cristatum發酵葛根的抗氧化活性優于未發酵葛根[27]；E.cristatum發酵的豆渣提取物可作為潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑，并可以明顯降低餐后血糖水平[35]。通過體外試驗評價，研究了不同發酵時間所得到的MLF的α-葡萄糖苷酶抑制活性差異，結果見圖3。

圖3 E.cristatum CY-1發酵的桑葉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.3 The inhibition efficiency of α-glucosidase of flavonoids extracted from the fermented mulberry leaf of E.cristatum CY-1

由圖3可以看出，發酵后的MLF對α-葡萄糖苷酶的抑制率均明顯升高，當MLF濃度約為50 μg/mL時，未經發酵桑葉的MLF對α-葡萄糖苷酶的抑制率為66.76%，而發酵10 d的桑葉MLF對α-葡萄糖苷酶的抑制率則達到90.54%。

對不同發酵時間所得MLF濃度與ɑ-葡萄糖苷酶抑制率進行擬合，結果表明ExpDec1模型的擬合效果較好，其擬合方程及R2見表2。

表2 發酵桑葉的黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率擬合參數Table 2 Fitting parameters of inhibition rate of flavonids extracted from fermented mulberry leaves on the α-glucosidase

發酵后的MLF對ɑ-葡萄糖苷酶的IC50均發生了明顯的降低，且發酵時間越長，IC50值越低，其中經E.cristatum CY-1發酵10 d的桑葉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的IC50由未發酵MLF的25.955 μg/mL降至4.925 μg/mL。這說明E.cristatum CY-1發酵可以有效地改善MLF對α-葡萄糖苷酶的抑制能力。雖然E.cristatum CY-1發酵桑葉在第10天時MLF（10）含量相對于發酵第8天的MLF（8）最高值減少了47.6%，但是它對α-葡萄糖苷酶的IC50值為11.670 μg/mL，明顯高于MLF（10）。這可能是在發酵后期，微生物及其酶的作用使得黃酮類物質分解形成了新的結構及產物，而后者具有更強的α-葡萄糖苷酶的抑制能力[33-34]。

3 結論

論文研究了冠突散囊菌E.cristatum CY-1固態發酵對新鮮桑葉中總黃酮含量及其α-葡萄糖苷酶的抑制活性等的影響，取得了如下主要結論：E.cristatum CY-1能夠以新鮮桑葉為發酵基質進行生長，并在發酵第8天趨于穩定，發酵30 g鮮桑葉E.cristatum CY-1的生物量達到378.2 mg。發酵過程中，桑葉的總黃酮含量呈現先升高后降低的趨勢，在第8天桑葉黃酮含量相對于未發酵桑葉提高了78.72%，但之后明顯降低。經E.cristatum CY-1發酵后的桑葉，其黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨發酵時間的延長而不斷升高，半抑制濃度（IC50）則明顯降低。發酵10 d的桑葉，其黃酮提取物和未發酵桑葉的黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的 IC50值分別為 4.925 μg/mL 和 25.995 μg/mL。由此可見，冠突散囊菌發酵可以有效地增強桑葉黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制能力。