石胡荽醇提物制備工藝優化及其不同萃取部位抗炎活性研究 Δ

楊柳 ，楊艷 ，高奇 ，文雯 ，王麗 ，楊小生 ，楊娟 （1.貴州中醫藥大學藥學院，貴陽 55005；.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴陽 550014）

石胡荽為菊科石胡荽屬石胡荽Centipeda minima（L.）A. Braun et Aschers.的全草，又名鵝不食草，主要分布于我國廣西、湖北、浙江等地[1]。其味辛、性溫，歸肺、肝經，具有發散風寒、通鼻竅、鎮痛消炎、止咳、解毒等功效，用于治療百日咳、鼻炎和鼻竇炎、瘧疾、關節扭傷、風濕疼痛等癥[2]。石胡荽中已報道的化學成分主要為倍半萜類、三萜及其苷類、黃酮及其苷類、揮發油類等[3]。研究發現，三萜類化合物具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低膽固醇等多種生物活性[4―5]。近年來，關于石胡荽三萜類化合物的化學成分組成[6―8]、藥理作用[9―12]、臨床應用及質量控制[13―14]等方面的研究已有較多報道。成光宇等[15]曾利用加熱回流提取法和正交實驗優化石胡荽總三萜皂苷的提取工藝，但正交實驗存在實驗次數多、未考慮因素之間的相互影響等不足。響應面法目前被廣泛應用于中藥提取工藝研究中[16―18]，該法可通過將實驗結果進行方差分析、回歸分析來尋求最佳工藝參數，實現實驗設計、回歸分析、預測優化的功能，可彌補正交實驗的缺陷。本研究擬在單因素實驗的基礎上，采用響應面法進一步綜合分析影響熱回流提取石胡荽醇提物的關鍵因素，確定最佳工藝參數；在此基礎上，采用系統溶劑萃取法得到石胡荽醇提物的不同萃取部位，并初步考察不同萃取部位的抗炎活性，以期為該植物資源的合理開發利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：UV-1800型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司），OSB-2200型旋轉蒸發儀（日本EYELA株式會社），BT25S型電子分析天平（德國Sartorius公司），DK-98-Ⅱ型恒溫水浴鍋（美國Trisite公司），CCL-170B-8型CO2細胞培養箱（新加坡ESCO公司），TS2 FL型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），EPOCH型多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 主要藥品與試劑

石胡荽藥材購自云南中藥市場，經貴州中醫藥大學藥學院孫慶文教授鑒定為石胡荽C. minima （L.） A.Braun et Aschers.的干燥全草；藥材標本存放于貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室（標本號為CM202106）。齊墩果酸對照品（批號PS0236-0100，純度≥99.0%）購自成都普思生物科技股份有限公司；地塞米松對照品（批號 D4902-25MG，純度≥97.0%）、脂多糖、胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（批號PS0236-0100）購自上海碧云天生物技術有限公司；MTT試劑購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、二甲基亞砜均為國產分析純，水為純化水。

1.3 細胞

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自上海中喬新舟生物科技有限公司，凍存于貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室。

2 方法與結果

2.1 石胡荽總三萜含量測定方法的確定

根據2020年版《中國藥典》（一部）中三萜含量的測定方法[19]，并結合中華人民共和國農業行業標準《靈芝總三萜含量的測定分光光度法：NY/T 3676-2020》[20]，確定本研究以齊墩果酸為對照品，采用紫外分光光度法（波長550 nm）測定石胡荽總三萜的含量。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品5.00 mg，置于25 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容，得到質量濃度為0.20 mg/mL的齊墩果酸對照品貯備液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取石胡荽粗粉1.00 g，置于150 mL錐形瓶中，加70%乙醇40 mL，稱定質量后加熱回流提取2.0 h。提取完畢后將提取液靜置，冷卻后再次稱質量并補足減失的質量，過濾除雜；濾液減壓濃縮干燥后用乙醇轉移至25 mL容量瓶中并定容，得到供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的繪制 準確移取齊墩果酸對照品貯備液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于10 mL試管中。將試管置于90 ℃的水浴鍋中揮干溶劑，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.10 mL、高氯酸0.80 mL，混勻后于60 ℃水浴中保溫顯色20 min，取出后迅速置于冰水浴中冷卻5 min，終止顯色反應。然后加入5.00 mL冰醋酸，混勻，室溫放置10 min。以相應試劑為空白對照，于550 nm波長處測定吸光度。以齊墩果酸質量濃度為橫坐標（x）、吸光度為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為 y＝61.899 0x－0.0465 9（R2＝0.999 4）。結果表明，齊墩果酸在0.003 1～0.019 0 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取對照品貯備液適量，按“2.3.1”項下方法操作，連續測定6次吸光度。結果顯示，吸光度的RSD為 0.76%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液適量，按“2.3.1”項下方法操作，分別在顯色后0、10、20、40、60、80 min時測定吸光度。結果顯示，吸光度的RSD為0.78%（n＝6），表明供試品溶液顯色后在80 min內穩定。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取6份同一批石胡荽粗粉1.00 g，按照最優制備工藝制備供試品溶液，然后按“2.3.1”項下方法操作，測定吸光度，按照標準曲線法計算含量。結果顯示，含量的RSD為1.29%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.4 石胡荽總三萜提取率的測定

在最佳工藝條件下，精密吸取供試品溶液適量，按“2.3.1”項下方法操作，作為待測溶液，以相應試劑為空白對照，在550 nm波長處測定其吸光度，將吸光度代入“2.3.1”項下回歸方程計算出石胡荽總三萜的質量濃度，并按照下列公式計算石胡荽總三萜的提取率（y）：y（%）＝（xv1f/1 000v2m）×100%。式中，x為從標準曲線上查得的樣品反應液的總三萜質量濃度（mg/mL），v1為樣品定容時加入的乙醇體積（mL），f為樣品溶液稀釋倍數，v2為比色測定時移取的樣品提取液體積（mL），m為樣品的質量（g）。

2.5 單因素實驗篩選石胡荽醇提物的制備工藝因素

因乙醇體積分數、提取時間、料液比、提取次數4個因素對總三萜提取率影響較大[21―23]，故本研究以石胡荽總三萜提取率為指標，以乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、料液比（1︰10、1︰20、1︰30、1︰40、1︰50，g/mL）、提取次數（1、2、3、4、5次）為因素，在固定其余3個因素不變的條件下進行單因素實驗，平行3次，以確定各因素的優化區間，詳見圖1。

圖1 各因素對石胡荽總三萜提取率的影響（n＝3）

2.5.1 乙醇體積分數的影響 由圖1A可知，隨著乙醇體積分數的增加，石胡荽總三萜提取率呈先上升后下降的趨勢。在乙醇體積分數為70%時，石胡荽總三萜提取率達到最高，故本研究選擇乙醇體積分數60%～80%進行后續實驗。

2.5.2 提取時間的影響 由圖1B可知，隨著提取時間的延長，石胡荽總三萜提取率呈先上升后下降的趨勢。當提取時間為2.0 h時，總三萜的提取率最高；繼續延長提取時間，石胡荽總三萜提取率開始降低。因此，本研究選擇提取時間1.5～2.5 h進行后續實驗。

2.5.3 料液比的影響 由圖1C可知，隨著料液比的增加，石胡荽總三萜提取率呈先上升后下降的趨勢，當料液比為1∶40時，總三萜的提取率最高，故本研究選擇料液比1∶30～1∶50（g/mL）進行后續實驗。

2.5.4 提取次數的影響 由圖1D可知，隨著提取次數的增加，石胡荽總三萜提取率呈上升趨勢，但當提取次數達3次時上升趨于平緩。這說明藥材中的總三萜已基本提取完全，再增加提取次數也難以使石胡荽總三萜提取率有較大改變，考慮到提取成本問題，故本研究將提取次數固定為3次進行后續實驗。

2.6 響應面法優化石胡荽醇提物的制備工藝

以石胡荽總三萜提取率（Y）為響應值，以乙醇體積分數（A）、提取時間（B）、料液比（C）為響應因素，利用Design Expert 8.0.6軟件設計3因素3水平的響應面實驗以優化石胡荽醇提物的提取工藝。響應面實驗設計的因素與水平見表1，實驗方案和結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 響應面實驗設計的因素與水平

表2 響應面實驗設計方案和實驗結果

表3 響應面實驗方差分析結果

利用Design Expert 8.0.6軟件對實驗結果進行回歸擬合分析，得到回歸方程為Y＝1.160+0.077A+0.022B+0.043C+0.013AB+0.01AC－0.049BC－0.15A2－0.038B2－0.083C2。由表3可知，失擬項P＝0.182 4＞0.05，表明失擬不顯著，即該模型對本實驗擬合程度良好；R2＝0.905 8，說明石胡荽總三萜提取率的變化有90.58%來自所選的因素。因此，因素A、B、C對石胡荽總三萜提取率影響主次順序為：A＞C＞B，即乙醇體積分數＞料液比＞提取時間。

在其他因素不變的情況下，選取2個交互因素對石胡荽總三萜提取率進行響應面分析，利用Design Expert 8.0.6軟件繪制響應面圖和等高線圖（圖2）。結果顯示，A與C的交互作用顯著，即這2個因素的交互作用對石胡荽總三萜提取率的影響顯著。

圖2 各因素交互作用對石胡荽總三萜提取率影響的響應面圖和等高線圖

2.7 最佳制備工藝的確定與驗證

利用Design Expert 8.0.6軟件進行計算，得出石胡荽醇提物的實際最優制備工藝為：乙醇體積分數69.93%，提取時間2.09 h，料液比1∶39.50（g/mL），同時預測出石胡荽總三萜提取率為1.161%。結合實際操作的方便性，選擇乙醇體積分數70%、提取時間2.0 h、料液比1∶40（g/mL）為石胡荽總三萜醇提物的最佳制備工藝。

取石胡荽粗粉1.00 g，按照該工藝條件平行操作3次進行驗證，所得石胡荽總三萜的提取率分別為1.092%、1.165%、1.127%，平均提取率為1.134%（RSD＝0.03%），與預測值的相對誤差為0.02%。這說明該方法穩定、可靠，可用于石胡荽總三萜醇提物的制備。

2.8 石胡荽醇提物不同萃取部位的抗炎活性測定

2.8.1 樣品的制備 按照最佳工藝制備石胡荽醇提物，得率為11.42%。濃縮后，用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取得到不同萃取部位及萃取后剩下的水部位，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的總三萜含量分別為0.410%、0.455%、0.182%、0.109%。各部位干燥后分別稱取1.0 mg樣品，用二甲基亞砜溶解，備用。

2.8.2 不同萃取部位對RAW264.7細胞活力的影響 采用MTT法進行檢測。通過前期預實驗，本研究設置空白組和以萃取物濃度計的5個不同濃度（50、25、12.5、9.375、6.25 μg/mL）的藥物組，于490 nm波長處測定各組吸光度，具體方法參考文獻[24]。計算細胞活力：細胞活力（%）＝（藥物組吸光度/空白組吸光度）×100%。當細胞活力＞90%時，認為藥物是在安全濃度范圍內[25]。結果顯示，石油醚部位質量濃度為6.25 μg/mL、乙酸乙酯部位質量濃度為9.375 μg/mL、正丁醇部位質量濃度為12.5 μg/mL及水部位質量濃度為25 μg/mL時，RAW 264.7細胞的活力均大于90%，且差異無統計學意義（P＞0.05），故本研究選擇以上濃度進行后續實驗。結果見圖3。

圖3 不同提取部位對RAW264.7細胞活力的影響（±s，n＝3）

2.8.3 不同萃取部位對RAW264.7細胞NO生成的影響 利用脂多糖誘導RAW264.7細胞建立細胞炎癥模型[26]，設置空白組、加1 μg/mL脂多糖致炎的模型組和不同給藥濃度的藥物組，采用Griess試劑法于540 nm波長處測定不同組別的吸光度，以NO生成抑制率評價石胡荽總三萜醇提物不同萃取部位的抗炎活性，具體方法參考文獻[27]。NO生成抑制率（%）＝（模型組吸光度－藥物組吸光度）/（模型組吸光度－空白組吸光度）×100%。實驗重復3次。數據以±s表示，并通過Graphpad Prism 5.0軟件計算各藥物組的半數抑制濃度（IC50）。結果顯示，在實驗質量濃度范圍內，各部位的抗炎活性強弱排序依次為乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位，其對NO生成的IC50分別為2.22、2.44、＞100、＞100 μg/mL。石油醚部位、乙酸乙酯部位可不同程度地抑制NO生成，且其IC50均低于陽性對照藥物地塞米松（7.65 μg/mL）。正丁醇部位和水部位各個濃度對NO的生成無抑制作用，計算其IC50＞100 μg/mL，判斷這2個部位均無抗炎活性。結果見表4。

表4 各萃取部位對RAW264.7細胞NO生成的影響及IC50測定結果（n＝3）

3 討論

在前期研究中，筆者先是采用超聲輔助提取法對甲醇、乙醇進行考察，結果顯示，乙醇對石胡荽總三萜提取率較高。隨后，筆者以乙醇為溶劑，對回流提取法、超聲輔助提取法和冷浸漬法的提取效果進行考察，結果發現，3種提取方法中回流提取法提取率較后兩者高，故本研究采用乙醇回流提取法作為提取方法。經單因素實驗和響應面法分析發現，乙醇體積分數和料液比是影響石胡荽總三萜提取率的主要因素。通過響應面法確定乙醇體積分數70%、提取時間2.0 h、料液比1∶40（g/mL）、提取次數3次為最佳工藝，該工藝操作簡單、提取率高、可行性強，具有較強的實際應用價值。

NO是十分重要的炎癥介質，脂多糖在刺激RAW 264.7細胞產生急性炎癥反應的過程中會釋放大量的NO[28]。文獻報道，石胡荽粗提物[29―31]和部分三萜類化合物具有抗炎作用[32]。本研究采用地塞米松作為陽性對照藥物，比較了石胡荽醇提物不同萃取部位（石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位）的體外抗炎活性。結果顯示，抗炎活性強弱排序依次為乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位。其中，石油醚部位、乙酸乙酯部位均能較好地抑制脂多糖誘導小鼠RAW264.7細胞生成炎癥介質NO，且其IC50均低于陽性對照藥物地塞米松。

綜上所述，優化后的石胡荽醇提物制備工藝穩定可行，其石油醚部位、乙酸乙酯部位具有一定的抗炎活性。但本文結論仍需設計更為嚴密的藥理實驗加以驗證。