基于超快速氣相電子鼻技術(shù)研究中藥香囊放置過程中的氣味成分變化 Δ

于小聰 ，張禮欣 ，王澤琨 ，束雅春 ，張先林 ，姚毅 ，毛春琴 （.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學部，南京 009；.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 003）

中藥香囊是人類從古至今都在使用的裝載有芳香類中藥的預防與保健用品，現(xiàn)代香囊使用主要是佩戴于頸部、腰間、胸前、腳踝，亦可置于枕頭內(nèi)或床帳上[1]。辟疫香囊可用于預防和治療疾病，是應用最為廣泛、使用最早的一類中藥香囊，也是配方種類最多的一種[2―3]。目前有關(guān)中藥香囊的文獻研究主要集中于香囊的藥理作用和臨床效果觀察上[4―9]，而有關(guān)香囊的質(zhì)量控制、氣味研究鮮有相關(guān)文獻報道。且隨著放置時間增加，香囊的揮發(fā)性成分必然會損失，但揮發(fā)性成分的損失程度與放置時間的具體關(guān)系尚缺乏研究。因此對不同放置時間的中藥香囊進行氣味與成分研究可以為其使用時間提供一定的參考價值。本實驗所用的上工香囊分為2種，其中兒童型香囊配方為全國名中醫(yī)汪受傳教授的經(jīng)驗方，主要由肉桂、蒼術(shù)、艾葉、山柰等藥材組成；成人型香囊配方為國醫(yī)大師周仲瑛教授的經(jīng)驗方，主要由艾葉、肉桂、蒼術(shù)、石菖蒲、廣藿香、丁香等藥材組成。2種中藥香囊均屬于外用品，對外感風寒引起的感冒、頭疼、咽喉腫痛、嘔吐有一定的預防和治療功效[10]。

超快速氣相電子鼻是一款將氣相色譜技術(shù)與電子鼻識別技術(shù)相結(jié)合的仿生系統(tǒng)，其優(yōu)點是操作簡單、檢測快捷、靈敏度高，可檢測樣品整體信息形成氣味指紋圖譜，同時結(jié)合Kovats保留指數(shù)定性庫，可定性分析氣味成分，現(xiàn)已應用于食品、化工、農(nóng)業(yè)等多個領域[11―19]。揮發(fā)油成分是中藥香囊發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎，而目前有關(guān)中藥香囊揮發(fā)性成分的研究尚缺少客觀的量化指標。鑒于此，本研究采用Heracles NEO超快速氣相電子鼻技術(shù)獲取中藥香囊的氣味和成分信息，建立氣味信息圖譜，同時結(jié)合化學計量學方法建立判別因子分析模型對不同放置時間中藥香囊的氣味特征及成分進行分析，以期為其合理開發(fā)應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

Heracles NEO型超快速氣相電子鼻購自法國Alpha MOS公司（配備HS-100型自動進樣器）；FA1104N型電子天平購自上海菁海儀器有限公司；20 mL頂空進樣瓶購自廣州市鴻洲實驗器材科技有限公司。

1.2 香囊與混合對照品

兒童型香囊（編號A1～A15，批號20171202）和成人型香囊（編號B1～B15，批號20180101）均購自貴州同德藥業(yè)有限公司；正構(gòu)烷烴（nC6～nC16）混合對照品（批號A0142930，每100 g混合物中含有nC6～nC16共0.02～52.27 g）購自美國Restek公司。

2 方法

2.1 樣品前期準備

將中藥香囊放置在室內(nèi)，室內(nèi)溫度19～26 ℃，濕度55%～70%，放置時間見表1。

表1 中藥香囊放置時間

2.2 進樣條件考察

本實驗采用頂空進樣，為得到良好的分離效果，需要對檢測條件進行優(yōu)化，以確定最佳檢測條件。參考相關(guān)文獻[11―12]，通過氣相色譜圖分析，分別對進樣體積、孵化溫度、孵化時間進行單因素考察。

2.2.1 進樣體積考察 精密稱定樣品粉末0.5 g（編號A1）于頂空進樣瓶中，設置孵化時間為5 min，振搖溫度為45 ℃，考察進樣體積為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μL時各色譜圖中色譜峰峰形及色譜峰數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，當進樣體積為4 000 μL時，各色譜峰峰形穩(wěn)定且色譜峰強度達到飽和，故確定4 000 μL為最佳進樣體積。

2.2.2 孵化溫度考察 精密稱定樣品粉末0.5 g（編號A1）于頂空進樣瓶中，設置進樣體積為4 000 μL，孵化時間為5 min，考察孵化溫度分別為55、60、65、70、75 ℃時各色譜圖中色譜峰峰形及色譜峰數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，當孵化溫度為65 ℃時，各色譜峰峰形穩(wěn)定且色譜峰強度達到飽和，故確定65 ℃為最佳孵化溫度。

2.2.3 孵化時間考察 精密稱定樣品粉末0.5 g（編號A1）于頂空進樣瓶中，設置進樣體積為4 000 μL，孵化溫度為65 ℃，考察孵化時間分別為5、10、15、20、25 min時各色譜圖中色譜峰峰形及色譜峰數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，當孵化時間為15 min時，各色譜峰峰形穩(wěn)定且色譜峰強度達到飽和，故確定15 min為最佳孵化時間。

2.3 電子鼻檢測參數(shù)

根據(jù)單因素實驗考察確定的檢測條件，使用Heracles NEO型超快速氣相電子鼻對放置不同時間的2種香囊進行氣味分析。相關(guān)檢測參數(shù)如下：樣品瓶容積20 mL；樣品量為0.5 g；進體積為4 000 μL；孵化溫度為65 ℃；孵化時間為15 min；注射速度為125 μL/s；注射持續(xù)時間為37 s；進樣口溫度為200 ℃；進樣口壓力為10 kPa；捕集阱初始溫度為50 ℃，最終溫度為240 ℃；柱溫初始為50 ℃，采用程序升溫（以1 ℃/s升溫至70 ℃；以2 ℃/s升溫至 90 ℃；以 0.2 ℃/s升溫至 105 ℃；以 5 ℃/s升溫至250 ℃）；采集時間為136 s；火焰化離子檢測器增益為12。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度考察 精密稱定樣品粉末0.5 g（編號A1），共6份，按“2.3”項下條件進樣分析。選取峰面積較大且穩(wěn)定的7、8、9號峰作為特征峰，測定特征峰的峰面積。結(jié)果顯示，3個特征峰峰面積的RSD分別為3.5%、1.1%、1.7%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性考察 分別取6次樣品粉末0.5 g（編號A1），精密稱定，按“2.3”項下條件進樣分析。選取峰面積較大且穩(wěn)定的7、8、9號峰作為特征峰，測定特征峰的峰面積。結(jié)果顯示，3個特征峰峰面積的RSD分別為2.5%、1.5%、1.5%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 精密稱定樣品粉末0.5 g（編號A1），共6份，于進樣瓶中放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.3”項下條件進樣分析。選取峰面積較大且穩(wěn)定的7、8、9號峰作為特征峰，測定特征峰的峰面積。結(jié)果顯示，3個特征峰峰面積的RSD分別為1.7%、0.6%、1.5%（n＝6），表明樣品在進樣瓶中24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 判別因子分析

判別因子分析是一種用于構(gòu)建模型和判定個體所屬類別的統(tǒng)計方法。與主成分分析相比，其可使不同類組群數(shù)據(jù)間差異盡可能擴大，而使同類組群數(shù)據(jù)間差異盡可能縮小，從而建立更好識別的數(shù)據(jù)模型，更好地體現(xiàn)出樣品的差異性[11―12]。本研究采用Heracles NEO型超快速氣相電子鼻自帶的Alpha Soft V14.2軟件對不同放置時間中藥香囊的色譜圖數(shù)據(jù)進行判別因子分析。

3 結(jié)果

3.1 兒童型香囊氣味成分分析結(jié)果

通過對兒童型香囊（編號A1～A15）樣品粉末進行分析，得到不同放置時間樣品的色譜圖，見圖1。由圖1可知，隨著放置時間的延長，色譜峰的峰高逐漸降低、數(shù)量逐漸變少，說明不同放置時間兒童型香囊的氣味存在明顯差異。通過Kovats保留指數(shù)定性分析，并與電子鼻自帶的Arochembase數(shù)據(jù)庫信息匹配后共鑒定出10種氣味成分，結(jié)果見表2。其中，α-蒎烯（9號峰）作為天然香料，有著和松木樹脂類似的香氣，具有抗菌、殺菌作用，可以減輕炎癥反應、抑制腫瘤細胞生長、抗病毒等[20―21]；β-蒎烯（10號峰）同樣具有抑菌、抗腫瘤作用[20―22]。因此，可將α-蒎烯和β-蒎烯作為兒童型香囊的功能性指標成分。

表2 兒童型香囊氣味物質(zhì)基礎及感官描述信息

圖1 不同放置時間兒童型香囊的疊加色譜圖

不同放置時間下兒童型香囊的氣味信息鏡像對比圖見圖2。由圖2可知，兒童型香囊放置0.25 d后，有5種氣味成分消失。與放置0 d相比，放置0.25 d后，7號峰強度下降了45.8%，8號峰強度下降了21.8%，9號峰強度下降了14.4%；放置3.5 d后，7號峰強度下降了90.8%，8號峰強度下降了70.1%，9號峰強度下降了50.8%；放置7 d后，大部分氣味成分基本消失，9號峰強度下降了56.8%；放置30 d后，9號峰基本消失。

圖2 不同放置時間兒童型香囊的氣味信息鏡像對比圖

3.2 成人型香囊氣味成分分析結(jié)果

通過對成人型香囊（編號B1～B15）樣品粉末進行分析，得到不同放置時間樣品的色譜圖，見圖3。由圖3可知，隨著放置時間的延長，色譜峰的峰高逐漸降低、數(shù)量逐漸變少。尤其是放置15 d之后，色譜峰的峰高明顯降低。這說明不同放置時間成人型香囊的氣味存在明顯差異。通過Kovats保留指數(shù)定性分析，再與Arochem‐base數(shù)據(jù)庫信息匹配后共鑒定出8種氣味成分，詳見表3。其中，α-水芹烯（7號峰）是一種有薄荷味的天然香料，存在于桉樹油、小茴香油、肉桂葉油、松節(jié)油等多種揮發(fā)油中，具有抑菌、抗菌活性，可作為祛痰劑[23―25]。因此，可將α-蒎烯和α-水芹烯作為成人型香囊的功能性指標成分。

表3 成人型香囊氣味物質(zhì)基礎及感官描述信息

圖3 不同放置時間成人型香囊的疊加色譜圖

不同放置時間成人型香囊的氣味信息鏡像對比圖見圖4。由圖4可知，成人型香囊放置0.25 d后，有4種氣味成分消失；放置15 d后，6～8號峰消失，5號峰強度較放置0 d時下降了34.3%；放置30 d后，9號峰基本消失。

圖4 不同放置時間成人型香囊的氣味信息鏡像對比圖

3.3 2種香囊的判別因子分析結(jié)果

兒童型香囊色譜數(shù)據(jù)的判別因子分析結(jié)果顯示，判別因子1的貢獻率為95.643%，判別因子2的貢獻率為3.582%，累計貢獻率為99.225%，這說明判別因子分析模型可明顯區(qū)分不同放置時間的兒童型香囊樣品（圖5）。由圖5可知，放置0.25 d的香囊氣味成分與放置0 d的香囊可明顯區(qū)分；從放置3.5 d開始，隨著放置時間的延長，樣品點聚集，說明氣味成分變化越來越小。結(jié)合色譜圖的分析結(jié)果可知，放置7 d的兒童型香囊的功能性成分已經(jīng)基本揮發(fā)。可見，判別因子分析結(jié)果與色譜圖分析結(jié)果一致。

圖5 不同放置時間兒童型香囊樣品判別因子分析圖

成人型香囊色譜數(shù)據(jù)的判別因子分析結(jié)果顯示，判別因子1的貢獻率為66.635%，判別因子2的貢獻率為25.330%，累計貢獻率為91.965%，這說明判別因子分析模型可明顯區(qū)分不同放置時間的成人型香囊樣品（圖6）。由圖6可知，放置0.25 d的樣品與放置0 d的樣品有明顯區(qū)別。隨著放置時間的延長，各樣品點距離放置0 d的樣品點越來越遠，說明其氣味成分發(fā)生了較大變化。結(jié)合色譜圖的分析結(jié)果可知，放置15 d的成人型香囊的功能性成分已經(jīng)基本揮發(fā)。由此可見，判別因子分析模型分析結(jié)果與色譜分析結(jié)果一致。

圖6 不同放置時間成人型香囊樣品判別因子分析圖

4 討論

我國自古以來就有佩帶中藥香囊預防疾病的做法。中藥香囊源于傳統(tǒng)醫(yī)學“衣冠療法”，通過口鼻吸入和皮膚、經(jīng)絡吸收而發(fā)揮避穢濁、防御疾病的功效。其使用歷史悠久，早在殷商甲骨文中即有熏燎、艾蒸和釀制香酒的記載；《山海經(jīng)》曰：“佩之可以已癘”；漢代已有使用香囊進行避穢、防御疾病的記載，明清時期發(fā)展到頂峰。清徐大椿著《神農(nóng)本草經(jīng)百種錄》曰：“香者，氣之正，正氣盛則除邪辟穢也”。至今，民間有“帶個香草包，不怕五蟲害”之風俗。佩戴香囊是極具特色的中醫(yī)外治法，目前廣泛用于避邪除穢、調(diào)攝養(yǎng)生和預防疾病。

目前電子鼻多用于酒、茶、飲料、果蔬、肉制品、油脂等食品領域，以及飲片產(chǎn)地加工炮制等中藥領域。應用電子鼻系統(tǒng)代替人類的嗅覺系統(tǒng)，將氣味差異和氣味濃淡這種主觀評價轉(zhuǎn)化成為數(shù)字化的客觀定量描述，能夠反映中藥“整體氣味特征”，符合中藥“整體論”觀點。同時，電子鼻與其他檢驗儀器相比，具有快速、低檢測限、高靈敏度等優(yōu)點。

根據(jù)本研究色譜圖與判別因子分析結(jié)果可知，兒童型香囊在放置3.5 d后其中的α-蒎烯和β-蒎烯2個成分峰的強度大幅下降；放置7 d后，大部分成分基本消失。因此，筆者建議兒童型香囊的使用時間為7 d。成人型香囊在放置15 d后，其中α-蒎烯和α-水芹烯2個成分峰消失。因此。筆者建議成人型香囊的使用時間不超過15 d。不同藥味組成的香囊組方，其放置時間有所不同，但總體而言，隨著放置時間的延長，香囊中芳香揮發(fā)性成分將日益減少，有效性會逐漸降低。因此，建議消費者購買香囊以后，使用時再行拆封、佩戴。若晚間不佩戴時，用密封袋（盒）盡可能封好，以減少揮發(fā)性成分的損失。此外，香囊的氣味變化還可能與溫濕度有關(guān)，并與香囊的有效期、保質(zhì)期有關(guān)。

綜上所述，隨著放置時間延長，2種中藥香囊的氣味成分均在不斷減少；建議兒童型香囊的使用時間為7 d，成人型香囊的使用時間為15 d。