不同濃度Fe2+對(duì)蛋白激發(fā)子AMEP聚合狀態(tài)以及活性的影響

張襄郟，劉銘，賴思彤，劉 權(quán)

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

農(nóng)藥是不可或缺的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在控制農(nóng)業(yè)有害生物，促進(jìn)農(nóng)業(yè)豐產(chǎn)與農(nóng)民增收，保障國(guó)家糧食安全等方面發(fā)揮著極其重要的作用。農(nóng)藥的使用實(shí)踐表明，農(nóng)藥使用可挽回全世界農(nóng)作物總產(chǎn)30%～40%的損失[1-2]。

廣義的生物農(nóng)藥，即生物源農(nóng)藥，是指直接利用生物活體或生物代謝過程產(chǎn)生的具有生物活性的物質(zhì)，或從生物體提取的物質(zhì)，以及人工合成的與天然化合物結(jié)構(gòu)相同的物質(zhì)，作為防治農(nóng)林作物病、蟲、草、鼠害的農(nóng)藥。狹義的生物農(nóng)藥，是指直接利用生物活體（微生物、動(dòng)物、植物）作為農(nóng)藥[3-4]。本試驗(yàn)研究的AMEP蛋白多聚體屬于廣義上的生物農(nóng)藥。生物農(nóng)藥作為國(guó)家生物農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中重要的組成部分，在農(nóng)作物病蟲害防治上發(fā)揮著不可或缺的作用。由于生物農(nóng)藥具有自然降解快、對(duì)病蟲害選擇性強(qiáng)、對(duì)人畜毒性低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病蟲害防治，特別是在無(wú)公害和有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。生物農(nóng)藥已成為保障人類健康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要手段[5]。

許多蛋白質(zhì)激發(fā)子已從多種病原體中分離出來(lái)，包括細(xì)菌中的鞭毛蛋白和harpin[6-7]，真菌木聚糖酶[8]，酵母轉(zhuǎn)化酶[9]和卵菌激發(fā)素[10]。然而，一些來(lái)自生防菌株的蛋白質(zhì)激發(fā)子也被報(bào)道可激發(fā)抗病性，如來(lái)自枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的Fengycins和Surfacetins[11]，來(lái)自液化淀粉芽孢桿菌的PEBA1[12]和Bar11[13]。本試驗(yàn)從枯草芽孢桿菌BU412中分離鑒定得到一種新型的AMEP蛋白多聚合體[14]，它能夠引起煙草的過敏反應(yīng)，同時(shí)還可引起煙草的早期防御反應(yīng)，如活性氧（H2O2和O2-）的產(chǎn)生和防御酶的激發(fā)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL），以及激發(fā)煙草對(duì)灰霉病產(chǎn)生抗性。該蛋白兼具拮抗植物病原菌和激發(fā)植物抗逆能力的效果，是蛋白類生物農(nóng)藥的理想候選。

本試驗(yàn)通過Fe2+對(duì)蛋白質(zhì)聚合狀態(tài)的影響及其與蛋白功能活性的相互關(guān)系，篩選獲得AMEP蛋白的不同多聚體狀態(tài)，并檢測(cè)不同聚合狀態(tài)下該蛋白的抗菌和激發(fā)免疫功能活性，并通過過敏反應(yīng)試驗(yàn)和灰霉抗病試驗(yàn)確定Fe2+對(duì)AMEP蛋白影響作用，為Fe2+與AMEP蛋白的混合使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的菌株為枯草芽孢桿菌BU412保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCCM2016142)，用于提取制備AMEP蛋白。煙草植株（Nicotiana tabacum）用于過敏反應(yīng)試驗(yàn)，本氏煙（Nicotiana benthamiana）用于灰霉菌接病試驗(yàn)。灰霉菌株（Botrytiscinerea）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑包括酵母提取物、葡萄糖、胰蛋白胨、氯化鈉、磷酸緩沖液、核黃素、NBT、鄰苯二酚、Tris、HCl、FeSO4·7H2O、L-苯丙氨酸溶液、愈創(chuàng)木酚、L-甲硫氨酸、氯化鈉、硫酸銅、氯化錳、氯化鎂、氯化鉀、硫酸鈣、氯化鐵、硫酸亞鐵、氯化鎳和硫酸鋅。

主要試驗(yàn)器材包括立式高溫滅菌鍋、磁力加熱攪拌器、電子天平、pH計(jì)、恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超微量分光光度計(jì)、心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、紫外微量分光光度計(jì)、搖床震蕩器、漩渦混勻器、研缽、超凈工作臺(tái)、AKTA purifier蛋白純化儀等。

1.2 AMEP蛋白的制備

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 LB培養(yǎng)基（g·L-1）：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，氯化鈉10.0，pH 7.0；YME培養(yǎng)基（g·L-1）：酵母提取物4.0，麥芽提取物10.0，葡萄糖4.0，pH 7.2。分裝后，進(jìn)行120℃高壓蒸汽滅菌。

1.2.2 菌種活化及接種發(fā)酵 將枯草芽孢桿菌BU412的單菌落接種在3 mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，于30℃、170 r·min-1培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)液按照1∶100的比例再次接種至300 mL YME液體培養(yǎng)基中，于30℃、170 r·min-1培養(yǎng)24 h。

1.2.3 蛋白的分離純化 待發(fā)酵24 h后，將培養(yǎng)液以4℃、11 000 r·min-1條件下離心15 min，得到上清液，并通過0.22μm膜過濾上清液，將過濾后的粗酶液進(jìn)行進(jìn)一步純化，使用20 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）的緩沖液預(yù)先平衡DEAE陰離子交換樹脂，將離心后的上清液穿過DEAE陰離子交換樹脂，使用含有1 mol·L-1NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集蛋白樣品。將收集的蛋白溶液放入冰箱保存。

1.2.4 蛋白的濃縮 預(yù)先使用超純水清洗超濾管，然后使用移液器將收集到的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到5 mL 30 KD的超濾管中，經(jīng)配平后在4℃、4 000 r·min-1的條件下超濾濃縮，待濃縮至1.5 mL時(shí)，在使用移液器向超濾管中加入低鹽溶液至原體積，在進(jìn)行超濾濃縮至1.5 mL。重復(fù)加低鹽操作3次后，使用移液槍吸取上方蛋白溶液，棄去下方溶液。

1.2.5 蛋白的處理 采用單因素和多級(jí)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)粗酶液進(jìn)行添加金屬離子處理。離子種類和濃度：鈉離子、銅離子、錳離子、鎂離子、鉀離子、鈣離子、亞鐵離子、鎳離子和鋅離子，濃度均為0.005g·L-1。將不同金屬離子處理過的粗酶液注入AKTA純化儀中，用凝膠過濾柱進(jìn)行分離，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，每隔4.8 s讀數(shù)1次，利用Excel繪制出圖表，分析不同金屬離子對(duì)AMEP蛋白質(zhì)聚合狀態(tài)的影響。

1.3 多聚體的獲得

1.3.1 蛋白濃度的測(cè)定及稀釋 對(duì)得到的相對(duì)分子質(zhì)量為30 KD以上的蛋白濃縮液使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度，再根據(jù)測(cè)得的濃度用低鹽將其稀釋至1 mg·mL-1。

1.3.2 不同F(xiàn)e2+濃度蛋白質(zhì)多聚體的制備 分別將濃度為0.2、0.4、0.5 g·L-1Fe2+處理過的蛋白溶液注入AKTA純化儀中，用凝膠過濾柱進(jìn)行分離，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，每隔4.8 s讀數(shù)1次，利用Excel繪制出圖表，分析不同濃度Fe2+離子對(duì)AMEP蛋白質(zhì)聚合狀態(tài)的影響。

1.4 過敏反應(yīng)

各取0.5 mL濃度為1 mg·mL-1的蛋白溶液與不同濃度的FeSO4溶液混合，分別得到1 mL濃度為0.03、0.3、3 g·L-1亞鐵離子的蛋白溶液，用于后續(xù)試驗(yàn)。采用煙草6周齡植株誘導(dǎo)抗病試驗(yàn)，以不加入硫酸亞鐵的同等濃度的蛋白溶液作對(duì)照，使用1mL注射器將上述不同聚合程度的蛋白溶液從煙草葉片背面滲透到葉片中，覆蓋1 cm2的面積，放入室溫、濕潤(rùn)、遮光的環(huán)境下，于24h觀察滲透區(qū)壞死情況并分析。

1.5 酶的活力測(cè)定

1.5.1 前處理 使用棉簽將上述不同聚合程度的蛋白溶液均勻涂抹到同等生長(zhǎng)狀況的大煙草葉片上并做好標(biāo)記，以不加入硫酸亞鐵的同等濃度的蛋白溶液為處理、低鹽溶液為對(duì)照。并用薄膜遮罩保濕，于24 h后進(jìn)行測(cè)酶活試驗(yàn)。

1.5.2 酶液的制備 用預(yù)冷的研缽將煙草葉片0.4 g和pH值為7.8的磷酸緩沖液4 mL，冰水浴中研磨，使用移液器將研磨勻漿轉(zhuǎn)入離心管中，4℃條件下，10 000 r·min-1離心20 min后再將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中待用。

1.5.3 超氧化物歧化酶（SOD）活力測(cè)定 預(yù)先配制SOD反應(yīng)液，將pH值為7.8的磷酸緩沖液、1 mg·mL-1的EDTA-2Na、20 mg·mL-1的L-甲硫氨酸、0.1mg·mL-1的核黃素、1mg·mL-1的NBT。按照此順序且體積比為15.5∶1∶1∶1∶1的比例來(lái)配制SOD反應(yīng)液。

選取型號(hào)相同的試管洗凈后晾干，向試管中加入3 mL反應(yīng)液，再吸取50μL的酶液并混勻。并把所有試管放置于4 000 lx光照條件下30 min，同時(shí)取4個(gè)試管（全不加酶液的磷酸緩沖液），3個(gè)作對(duì)照，1個(gè)作空白；空白置于暗處，對(duì)照與混合液光照條件相同，30 min后取出所有試管遮光保存，在560 nm下以空白調(diào)零，測(cè)吸光度。

1.5.4 過氧化物酶（POD）活力測(cè)定 預(yù)先配制POD反應(yīng)液，用pH值為6的磷酸緩沖液配制0.3%的愈創(chuàng)木酚溶液、用蒸餾水配制0.3%的過氧化氫溶液。最后按照80∶1的比例配制POD反應(yīng)液。在洗凈晾干的試管中加入3 mL反應(yīng)液，再加入50μL酶液搖勻，在470 nm下測(cè)吸光度（測(cè)量前取只試管加入3 mL反應(yīng)液調(diào)零），每隔1 min讀數(shù)1次，共讀3 min并做好記錄。用每分鐘內(nèi)OD值變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位(U)表示。

1.5.5 多酚氧化酶(PPO)活力測(cè)定 首先配制pH值為6的磷酸緩沖液，再配制0.1 mol·L-1的鄰苯二酚。隨后向洗凈后晾干的試管中加入pH值為6的磷酸緩沖液2 mL和0.1 mol·L-1鄰苯二酚1 mL，充分混勻后在37℃水浴鍋中水浴10 min后迅速加入70μL酶液并混勻，在420 nm下測(cè)吸光度，每15 s讀數(shù)1次，共讀45 s并做好記錄。

1.5.6 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力測(cè)定 預(yù)先配制pH值為7.8的磷酸緩沖液、再配制0.02 mol·L-1的L-苯丙氨酸溶液。配完后向試管中加入500μL酶液，磷酸緩沖液2.5 mL。混勻后在30℃水浴鍋中水浴30 min，水浴后向試管中加入6 mol·L-1HCl 0.2 mL終止反應(yīng)，然后在290 nm下測(cè)量吸光度。

1.6 灰霉抗病試驗(yàn)

1.6.1 預(yù)處理 選取同等生長(zhǎng)狀況的小煙草葉片，使用棉簽將上述不同聚合程度的蛋白溶液均勻涂抹到同等生長(zhǎng)狀況的小煙草葉片上并做好標(biāo)記，以不加入硫酸亞鐵的同等濃度的蛋白溶液為處理、低鹽溶液為對(duì)照。并用薄膜對(duì)涂抹完蛋白的小煙草進(jìn)行遮罩保濕，于24 h后進(jìn)行灰霉接種。具體分組處理為：“CK”組在葉片上涂抹低鹽溶液后接種灰霉，“1”組在葉片上涂抹不含F(xiàn)e2+的AMEP蛋白溶液后接種灰霉，“2”組在葉片上涂抹含低濃度Fe2+的AMEP蛋白后接種灰霉，“3”組在葉片上涂抹含中濃度Fe2+的AMEP蛋白后接種灰霉，“4”組在葉片上涂抹含高濃度Fe2+的AMEP蛋白后接種灰霉。

1.6.2 接種 用剪刀剪下做好標(biāo)記的小煙草葉片，并在小煙草背面放置事先培養(yǎng)的灰霉（含有灰霉菌絲的瓊脂塊），放入室溫、濕潤(rùn)、遮光環(huán)境下，于24 h后觀察葉片的灰霉染病（透明圈）情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)聚合體狀態(tài)的影響

如圖1所示，在11.04 min時(shí)，F(xiàn)eSO4·7H2O處理組有1個(gè)明顯的吸收峰，經(jīng)測(cè)定為目標(biāo)蛋白吸收峰，故選擇FeSO4·7H2O為最佳金屬離子進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)聚合體狀態(tài)的影響

2.2 不同F(xiàn)e2+濃度對(duì)蛋白質(zhì)聚合體狀態(tài)的影響

如圖2所示，在試驗(yàn)組中，亞鐵離子濃度的變化會(huì)對(duì)AMEP蛋白的聚合狀態(tài)產(chǎn)生相應(yīng)的影響，而AMEP蛋白聚合狀態(tài)的變化對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響還不確定，需要進(jìn)一步檢測(cè)不同亞鐵離子濃度對(duì)AMEP蛋白功能的影響。

圖2 不同濃度亞鐵離子對(duì)蛋白質(zhì)聚合狀態(tài)的影響

2.3 不同濃度Fe2+對(duì)AMEP過敏反應(yīng)活性的影響

本試驗(yàn)分別用0.03、0.3、3 g·L-1Fe2+和AMEP的混合溶液通過無(wú)針注射器注射，將溶液滲透到煙草葉片背面中，AMEP蛋白與經(jīng)過亞鐵離子處理過后的AMEP蛋白均可以引起煙草過敏反應(yīng)，如圖3所示。其中，以0.03 g·L-1Fe2+處理的AMEP蛋白最為明顯，3 g·L-1Fe2+顯著抑制AMEP蛋白的活性。如圖3所示，A為對(duì)照，即不加入Fe2+，僅使用蛋白溶液；B為低濃度組，即Fe2+濃度為0.03 g·L-1的蛋白溶液；C為中濃度組，即Fe2+濃度為0.3 g·L-1的蛋白溶液；D為高濃度組，即Fe2+濃度為3 g·L-1的蛋白溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫酸亞鐵濃度為0.03、0.3 g·L-1的處理組的過敏反應(yīng)癥狀比對(duì)照明顯，而3 g·L-1的硫酸亞鐵處理組的過敏反應(yīng)癥狀與對(duì)照沒有明顯差別（圖3）。推測(cè)亞鐵離子會(huì)增加AMEP412蛋白的聚合度，在低聚合度區(qū)間能夠增強(qiáng)蛋白活性，而當(dāng)亞鐵離子濃度過高時(shí)，AMEP412蛋白的聚合度過大，反而會(huì)阻礙其與植物細(xì)胞的互作。因此施用時(shí)緩沖液中Fe2+的濃度為0.03~0.3 g·L-1為適宜。

圖3 不同濃度的Fe2+對(duì)AMEP蛋白過敏反應(yīng)活性的影響

2.4 不同濃度Fe2+下AMEP蛋白對(duì)煙草葉片酶活的影響

試驗(yàn)根據(jù)向AMEP蛋白溶液加入Fe2+濃度的不同分為4個(gè)組，即“處理”組、“低”組、“中”組、“高”組，分別對(duì)應(yīng)的Fe2+濃度為0、0.03、0.3、3 g·L-1，并將僅涂抹低鹽溶液的葉片設(shè)置為對(duì)照組。如圖4所示，向AMEP蛋白溶液加入不同濃度的Fe2+后，酶的活性有不同程度的變化。在PAL、SOD酶活試驗(yàn)中，與處理組相比，低濃度組的酶活明顯提高，高濃度組的酶活則降低，說明低濃度Fe2+增強(qiáng)其活性，高濃度Fe2+抑制其活性；在POD、PPO酶活試驗(yàn)中，3種濃度組的酶活均低于處理組，即Fe2+會(huì)抑制AMEP蛋白對(duì)POD、PPO酶的激發(fā)作用，且抑制效果隨著Fe2+濃度的增加而增強(qiáng)，其中PPO酶尤為明顯，但與對(duì)照組相比，處理組的酶活明顯提高，說明AMEP蛋白能增強(qiáng)POD、PPO酶活性，加入Fe2+后抑制了其活性。

圖4 4種酶活性與不同濃度的Fe2+關(guān)系

2.5 不同濃度Fe2+下AMEP蛋白對(duì)煙草抗灰霉病效果的影響

如圖5所示，對(duì)照組為在葉片上涂抹低鹽溶液后接種灰霉，處理組為在葉片上涂抹不含F(xiàn)e2+的蛋白溶液后接種灰霉，低Fe2+組為在葉片上涂抹含低濃度Fe2+的蛋白后接種灰霉，中Fe2+組為在葉片上涂抹含中濃度Fe2+的蛋白后接種灰霉，高Fe2+組為在葉片上涂抹含高濃度Fe2+的蛋白后接種灰霉。結(jié)果顯示，沒有蛋白涂抹的對(duì)照組葉片透明圈最大，即灰霉侵染最嚴(yán)重，處理組由于涂抹了蛋白溶液，進(jìn)而增強(qiáng)了葉片的抗病性，透明圈顯著縮小。低Fe2+組沒有透明圈，即暫時(shí)沒有被灰霉侵染，說明低濃度Fe2+增強(qiáng)了蛋白的活性。高Fe2+組的透明圈比處理組的大而又比對(duì)照組的小，說明高濃度Fe2+并不能增強(qiáng)蛋白的活性，反而會(huì)使蛋白溶液活性受到抑制。

圖5 灰霉抗病處理組

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，金屬離子對(duì)牛乳中β-乳球蛋白聚合的研究越來(lái)越多。有學(xué)者在對(duì)牛乳中β-乳球蛋白的研究中提出Ca2+參與β-乳球蛋白聚合有3種可能：第1種是二價(jià)陽(yáng)離子與鄰近的帶負(fù)電的基團(tuán)或羧基結(jié)合形成“蛋白-Ca-蛋白”聚合體；第2種是金屬離子的加入，降低蛋白分子間的靜電斥力，促進(jìn)其聚合；第3種是金屬離子誘導(dǎo)蛋白分子結(jié)構(gòu)的改變，分子間的疏水相互作用隨之改變，誘導(dǎo)分子間聚合[15-16]。

本試驗(yàn)主要研究Fe2+濃度對(duì)AMEP蛋白活性的影響，通過使用含不同濃度Fe2+的蛋白溶液處理煙草葉片，并分別從過敏性、抗灰霉性、酶活3個(gè)方面對(duì)煙草進(jìn)行檢測(cè)。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，低濃度的Fe2+會(huì)增強(qiáng)AMEP蛋白的活性，反應(yīng)如活性氧（H2O2和的產(chǎn)生和防御酶的激發(fā)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL），以及對(duì)灰霉病的抗性，高濃度Fe2+則會(huì)稍微減弱AMEP蛋白的活性。

謝秀玲[14]發(fā)現(xiàn)，不同離子濃度會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成不同聚合物。當(dāng)β-乳球蛋白與金屬離子的摩爾比是1∶1時(shí)，聚合作用最強(qiáng)，二聚體含量最多。有研究報(bào)道，1個(gè)β-乳球蛋白分子含有1個(gè)游離的巰基，當(dāng)巰基氧化后，可結(jié)合1個(gè)金屬離子，金屬離子進(jìn)而催化其形成聚合體[17]。因此，1∶1是最佳的金屬離子和β-乳球蛋白的摩爾比。本試驗(yàn)據(jù)此設(shè)置對(duì)應(yīng)濃度Fe2+（即低濃度）與AMEP蛋白進(jìn)行結(jié)合，并在此基礎(chǔ)上又設(shè)置了2個(gè)Fe2+濃度（即中濃度和高濃度），當(dāng)亞鐵離子與蛋白分子發(fā)生相遇時(shí)，不同濃度的亞鐵離子促使AMEP蛋白質(zhì)形成不同聚合程度的聚合體，造成蛋白質(zhì)的活性部位暴露程度不同，從而影響蛋白質(zhì)在煙草過敏反應(yīng)試驗(yàn)中的活性。最終結(jié)果表明，低濃度Fe2+會(huì)加強(qiáng)AMEP活性，原因可能是此濃度的Fe2+使AMEP蛋白形成了更多適宜其發(fā)揮蛋白性能的多聚體，即保存其能更好地保存酶解位點(diǎn)使其不易被酶分解又能很好地發(fā)揮其性能的中間狀態(tài)。然而，過高濃度的亞鐵離子溶液會(huì)使得蛋白質(zhì)聚合程度過大，形成的蛋白質(zhì)多聚體難以附著在細(xì)胞表面，造成AMEP蛋白質(zhì)對(duì)煙草細(xì)胞的親和力下降，從而大大降低了蛋白質(zhì)的活性。

本研究通過酶活檢測(cè)得出結(jié)論，向蛋白溶液加入不同濃度的Fe2+后，PAL、SOD、POD、PPO酶活均有不同程度的提高，其中低濃度組的酶活提高得更明顯。PAL和SOD中高濃度組酶活較對(duì)照組低，說明高濃度Fe2+下的蛋白溶液會(huì)抑制其活性；POD和PPO中高濃度組的酶活雖然沒有低濃度組的高，但是相較于對(duì)照組酶活仍有提高，說明高濃度Fe2+下的蛋白溶液不會(huì)抑制其活性。又通過過敏反應(yīng)試驗(yàn)和灰霉抗病試驗(yàn)進(jìn)一步確定低濃度Fe2+能夠提高AMEP蛋白活性，高濃度Fe2+則會(huì)抑制AMEP蛋白活性。該結(jié)論說明合理的利用Fe2+可以增強(qiáng)AMEP蛋白的功能活性，為今后AMEP蛋白的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。