乙蟲腈對映體在蚯蚓體內的累積行為

馮躍梁，程有普，郝培培，張彩霞

（1．天津農學院園藝園林學院，天津 300384；2．天津市綠亨化工有限公司，天津 300270）

乙蟲腈（ethiprole）屬苯基吡唑類手性殺蟲劑，能夠防治多種咀嚼式口器和刺吸口器害蟲，目前已在中國登記，并大量應用于防治水稻中的稻飛虱[1]。水稻是我國主要糧食作物之一，也是我國種植面積較大的糧食作物之一[2]，由此可見，對乙蟲腈的環境風險評估是重中之重。乙蟲腈有1個手性中心，2個對映體。手性農藥暴露在手性環境中時往往在吸收、累積和降解過程中表現出不同的對映體選擇性[3]。研究手性農藥對映體的立體選擇性是在對映體水平上全面評價手性農藥環境行為的重要組成部分，既有助于手性農藥環境風險評估，又對有效單體的開發意義重大。

蚯蚓在土壤生態系統中，是最重要的生物因子之一，在土壤中充當消費者、分解者和調節者的角色[4]。蚯蚓對土壤污染物很敏感，通過吸收、代謝可以清除一些污染物，如農藥、多氯聯苯、多環芳烴和重金屬[5-6]。目前，蚯蚓被認為是一種監測土壤表層中的污染物的指示生物，廣泛應用于毒理學試驗[7]。目前尚未見從對映體角度研究乙蟲腈在蚯蚓中的生物累積行為，基于此，本研究擬從對映體角度探討乙蟲腈在蚯蚓體內富集行為，從而為全面評價乙蟲腈的環境行為和提高對映體水平上的生態風險認識提供一定的數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

赤子愛勝蚓（Eiseniafoetida），天津市賈立明蚯蚓養殖公司，供試生物選取健康、大小相似（300~350 mg）且帶有生殖環帶的蚯蚓。人工土壤按照OECD準則配制。配比為：石英砂68.0%（過80~120目篩），高嶺土20.0%（高嶺石含量大于30.0%），泥炭蘚10.0%，用碳酸鈣調節人工土壤pH值為7.0±0.5，混合均勻后備用。

1.2 試驗試劑

乙蟲腈外消旋體（對映體比例1∶1，純度95.6%）由農業農村部農藥檢定所提供；R-（+）,S-（-）乙蟲腈由上海勤路生物技術有限公司制備（光學純度大于99.0%）；色譜純甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、冰醋酸購于默克公司；分析純甲醇、乙腈、分析純氯化鈉、分析純無水硫酸鎂購于天津津科精細化工研究所；超純水由MilliQ超純水制備系統制備；Pesti-Carb/PSA、氧化鋁、氨基、PSA、佛羅鋁硅土固相萃取柱（500mg/6mL/30pkg）購于博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 試驗儀器

超臨界流體串聯質譜(SFC-MS/MS)(Waters，美國)；樣品管理器、柱溫箱、二元溶劑管理器、補償泵、三重四級桿質譜檢測器Xevo-TQD和MasslynxV.4.1工作站、人工氣候箱（寧波賽福實驗儀器有限公司，中國）；OD-3多糖涂敷型手性色譜（長度均為150 mm，內徑2 mm）（大賽璐藥物手性技術有限公司，日本）。

1.4 試驗方法

1.4.1 蚯蚓染毒 試驗設置單體濃度為0.5、5.0、12.5 mg·kg-1的3個處理組以及空白對照組。將乙蟲腈溶于丙酮，加入到裝有石英砂的培養皿中，將其放入通風櫥中，使丙酮充分揮發，藥砂與人工土混勻，每個燒杯中加入15條蚯蚓。通過稱質量補水，使土壤濕度保持在40%~60%。人工氣候箱的設置條件為濕度80%~85%、溫度（20±1）℃、光暗比16∶8。定期（2 h、1、2、3、5、7、10、14、21、28 d）取全部蚯蚓和50 g土壤。取出蚯蚓用純凈水洗凈體表后，置于干凈濕潤的濾紙上清腸6 h，用吸水紙擦干體表后稱質量。蚯蚓和土壤樣品均置于聚乙烯樣品袋中，并且在-20℃下冷凍保存。

1.4.2 蚯蚓和人工土樣品處理 蚯蚓樣品轉移到10.0 mL離心管中，加入鋼珠，震蕩20 min，完成后取出備用。稱取2.0 g蚯蚓基質，加入20.0 mL 1%醋酸乙腈，震蕩15.0 min，加入1.0 g NaCl和2.0 g無水MgSO4，渦旋5.0 min，吸取15.0 mL上清液加入到50.0 mL茄形瓶中，用旋轉蒸發儀旋干溶劑，加入色譜純乙腈復溶，備用。將PC/PSA小柱用10.0 mL乙腈活化，加入已備好的復溶液，并收集流出液，以V（甲苯）∶V（乙腈）=1∶3溶液5.0 mL做洗脫液，一并收集，旋干，用1.5 mL色譜純乙腈復溶。用注射器吸取上清液，通過0.22μm尼龍膜注，進行SFC-MS/MS分析。

將10.0 g人工土樣品放入50.0 mL離心管中，加入10.0 mL去離子水，加入10.0 mL1%醋酸乙腈，渦旋震蕩15.0 min后，加入2.0 g NaCl和4.0 g無水MgSO4，震蕩5 min，在2 811×g條件下離心5.0 min，吸取1.5 mL上清液加入到裝有50.0 mg C18+150.0 mg無水硫酸鎂的2.0 mL離心管中，震蕩1.0 min，放入離心機中，在離心力為2 811×g條件下，離心5.0 min。用注射器吸取上清液，過0.22μm尼龍膜，進行SFC-MS/MS分析。

1.4.3 儀器分析方法 本試驗使用超臨界流體串聯質譜（SFC-MS/MS）對樣品進行分析。其中具體的源參數包括毛細管電壓、離子源溫度、脫溶溫度、錐狀氣體流量和脫溶氣體流量分別設定為3.5 kV、150.0℃、500.0℃、30.0 L·h-1、800.0 L·h-1。乙蟲腈的母離子質量分數為394.9，定性離子質量分數為250.1，碰撞電壓為35.0 V，錐孔電壓為20 V。定量離子質量分數為331.0，碰撞電壓為15.0 V，錐孔電壓為20.0 V。乙蟲腈對映體的最佳拆分條件為：OD-3涂敷型手性色譜柱；改性劑比例V（CO2）∶V（IPA）=90∶10；流速：1.8 mL·min-1；柱溫：30.0℃；背壓：2 000.0 Psi。

1.4.4 數據分析方法 以對映體分數(EF)表示手性農藥的對映體選擇性。其中，EF=C(+)/[C(-)+C(+)][8]。EF值的定義范圍為0~1，EF=0.5表示外消旋體；EF值低于0.5，說明(-)-乙蟲腈優先降解，反之亦然。乙蟲腈對映體的相對累積用生物-土壤累積因子(BSAF)表示。

式中，CEW為蚯蚓體內農藥濃度；CS為土壤初始農藥濃度和最終農藥濃度的平均值[9-10]。

使用SPSS17.0進行數據處理、差異顯著性分析和單因素方差分析，使用Excel制圖。數據均采用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 建立前處理方法

2.1.1 蚯蚓 考察4種提取劑（乙腈、1%甲酸乙腈、1%醋酸乙腈、5%醋酸乙腈），結果只有1%醋酸乙腈的回收率在80%~120%之間，故選取1%醋酸乙腈作為提取劑。蚯蚓體內脂質較多，使用QuEChERS方法中的凈化劑可能對脂質清除不徹底。因此，在本試驗中對QuEChERS前處理方法進行改良，結合固相萃取技術（SPE）對蚯蚓基質進行凈化，試驗凈化效果良好。蚯蚓中含有色素及脂質物，分別使用PSA固相萃取柱、Alumina N固相萃取柱、Florisil固相萃取柱、C18固相萃取柱、PC/PSA固相萃取柱對蚯蚓基質進行凈化。結果顯示，PC/PSA固相萃取柱的回收率優于PSA固相萃取柱和C18固相萃取柱，且凈化色素效果更好，所以選擇PC/PSA固相萃取柱作為蚯蚓的凈化劑。

配制200 mg·L-1的標準母液，將母液稀釋制備成濃度依次為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg·L-1的溶劑標。使用空白基質提取液對母液進行稀釋，同樣制備成上述濃度的基質標。通過樣品檢測，使用Execl進行線性回歸分析，得出（+）-乙蟲腈的線性方程為y=223.94x+2 945，R2=0.998 7。（-）-乙蟲腈的線性方程為y=213.62x+2637.3，R2=0.998 6。通過對精密度和準確度驗證，（+）-乙蟲腈的回收率為100.1%~104.7%，RSD為1.5%~5.7%；（-）-乙蟲腈的回收率為91.6%~104.4%，RSD為2.5%~6.9%。

2.1.2 人工土 考察上述4種提取劑，酸化乙腈的提取效率效果比乙腈的效率高，1%甲酸乙腈回收率過高，1%醋酸乙腈和5%醋酸乙腈的回收率相近，基于節省成本、溶劑浪費和環境保護的角度，選擇1%醋酸乙腈作為人工土中乙蟲腈的提取劑。考察5種凈化劑組合（20 mg C18+150 mg無水MgSO4；40 mg C18+150 mg無 水MgSO4；50 mg C18+150 mg無 水MgSO4；40 mg PSA+150 mg無水MgSO4；50 mg PSA+150 mg無水MgSO4），最終選擇50 mg C18+150 mg無水MgSO4作為凈化劑。

按2.2.1方法進行試驗，得出（+）-乙蟲腈在人工土中的線性方程為y=216.89x+10 503，R2=0.999 0；（-）-乙蟲腈的線性方程為y=202.74x+10 054，R2=0.999 0。通過對精密度和準確度驗證，和回收率的計算（添加回收試驗中的樣品峰面積比上基質標峰面積×100%），（+）-乙蟲腈的回收率為86.8%~107.0%，RSD為3.6%~4.4%；（-）-乙蟲腈的回收率為89.5%~107.4%，RSD為2.4%~8.0%。

2.2 蚯蚓在單體濃度為0.5 mg·kg-1條件下的累積行為

試驗結果顯示，人工土中的乙蟲腈對映體在前21 d內表現穩定，但是在28 d時，（+）-乙蟲腈濃度降解較大，降解率超過20%，根據OECD準則要求，第21天的降解率未超過20%，因此在21 d換土更合適。蚯蚓體內的乙蟲腈單體濃度在2 d達到最大值，隨后蚯蚓體內的乙蟲腈單體濃度不斷降低，最終在14 d達到最低值，之后保持平穩狀態到28 d。

蚯蚓體內的EF值變化情況如圖1所示，隨著暴露時間的增加，蚯蚓體內乙蟲腈對映體的EF值不斷降低。這說明蚯蚓更傾向于吸收（-）-乙蟲腈。

圖1 0.5 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內乙蟲腈對映體的EF值

2個對映體的BSAF計算結果如圖2所示，隨著暴露時間增加，BSAF值在第2天達到最高，隨后不斷降低，最終趨于平穩。

圖2 0.5 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內乙蟲腈對映體的BSAF值

2.3 蚯蚓在5.0 mg·kg-1條件下的累積行為

乙蟲腈對映體在人工土中表現穩定。蚯蚓體內（-）-乙蟲腈和（+）-乙蟲腈在第3天達到最大值，隨后在14 d達到最低值，之后保持平穩狀態到28 d。蚯蚓體內的EF值如圖3所示。蚯蚓在吸收乙蟲腈對映體過程中存在選擇性，更易吸收（-）-乙蟲腈。BSAF結果如圖4所示，（+）-乙蟲腈在第2天達到峰值，隨后開始不斷下降。（-）-乙蟲腈在第3天達到峰值，隨后開始不斷下降。（+）-乙蟲腈的BSAF值為0.05~0.23，（-）-乙蟲腈的BSAF值為0.09~0.27。

圖3 5.0 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內乙蟲腈對映體的EF值

圖4 5.0 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內乙蟲腈對映體的BSAF值

2.4 蚯蚓在12.5 mg·kg-1條件下的累積行為

試驗結果顯示，乙蟲腈對映體在人工土中表現穩定。蚯蚓體內乙蟲腈對映體EF值變化情況由圖5所示。蚯蚓體內乙蟲腈的EF值低于0.5，說明（-）-乙蟲腈優先被累積，存在對映體選擇性。兩個對映體的BSAF計算結果如圖6所示，（+）-乙蟲腈的BSAF值均小于（-）-乙蟲腈，說明（-）-乙蟲腈在蚯蚓體內的濃度高。（+）-乙蟲腈的BSAF值為0.04~0.12，（-）-乙蟲腈的BSAF值為0.07~0.17。

圖5 12.5 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內乙蟲腈對映體的EF值

圖6 12.5 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內乙蟲腈對映體的BSAF值

在低中高3個濃度組中，乙蟲腈對映體在人工土中不易降解。3個濃度組中，蚯蚓體內的EF值均低于0.5，這表明蚯蚓對（-）-乙蟲腈優先在蚯蚓體內富集。

2.5 不同濃度下蚯蚓體內單體累積量

空白對照組中，蚯蚓體內并未檢測出（+）-乙蟲腈。由圖7可以看出，在0.5 mg·kg-1處理組中，蚯蚓體內（+）-乙蟲腈累積量在第2天達到最高值，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，之后開始下降，在第7天略有升高后，第10天開始下降，然后保持平穩狀態。在5.0 mg·kg-1處理組中，蚯蚓體內（+）-乙蟲腈在第2天達到峰值，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05），第3天開始下降，在第10天升高之后下降并保持平穩。在12.5 mg·kg-1處理組中，蚯蚓體內（+）-乙蟲腈在第1天達到最高濃度，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，在第10天下降到最低，之后保持穩定狀態。

圖7 蚯蚓體內（+）-乙蟲腈的累積濃度

空白對照組中，蚯蚓體內并未檢測出（-）-乙蟲腈。從圖8中可以看出，在0.5 mg·kg-1處理組中，蚯蚓體內（-）-乙蟲腈累積量在第2天達到最高，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，在第14天達到最低，接下來保持平穩。在5.0 mg·kg-1處理組中，（-）-乙蟲腈累積量在第2天達到最高，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，然后開始降低，最終保持穩態。在12.5 mg·kg-1處理組中，（-）-乙蟲腈累積量在第1天達到最高，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，然后開始降低，最終保持穩定狀態。

圖8 蚯蚓體內（-）-乙蟲腈的累積濃度

3 討論與結論

3.1 討論

乙蟲腈在蚯蚓體內累積行為試驗結果顯示，乙蟲腈在中性土壤中表現穩定，這與田發軍[11]和梁旭陽[12]得出的結論一致。但是，在0.5 mg·kg-1的人工土處理組中，前21 d EF值表現平穩，在第28天（+）-乙蟲腈濃度降低，導致人工土中的乙蟲腈EF值降低。此時（+）-乙蟲腈降解率超過20%，21 d的降解率低于20%。因此，在21 d時更換人工土，更換土壤后EF值表現平穩。本研究結果與高成玲[13]的呋蟲胺在蚯蚓體內富集研究相似。

在0.5、5.0 mg·kg-1處理組中，（+）-乙蟲腈和（-）-乙蟲腈在第2天達到最高，此時蚯蚓體內蓄積量與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，第14、21、28天差異不顯著（P＞0.05），達到穩態。在12.5 mg·kg-1處理組中，（+）-乙蟲腈和（-）-乙蟲腈在第1天達到最高，此時蚯蚓體內蓄積量與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，第10、14、21、28天差異不顯著（P＞0.05），達到穩態。這說明乙蟲腈生物累積主要發生在前期，污染程度越大，蓄積量越高。楊廣斌等[14]做過毒死蜱對蚯蚓累積特征研究，其結果與本研究類似。

通過3組乙蟲腈對映體的BSAF值對比筆者發現，隨著暴露濃度的增加，BSAF值反而降低。這種現象同樣出現在溴敵隆[15]和全氟烷基物質[16]中。原因可能是在高濃度的土壤或者沉積物中，生物體內可用于吸附的結合位點飽和疏水有機物的抗解吸性導致。Kelly等[17]在研究中表示log Kow在2~5的范圍內代表可能有吸附和累積的潛力。在PPDB（農藥特性數據庫）中獲得的乙蟲腈的logKow為1.99小于2。因此，乙蟲腈對映體在蚯蚓體內累積的可能性很低。高成玲[13]做過呋蟲胺在蚯蚓體內的富集行為研究，本研究結果與其相似。

3.2 結論

本研究建立了一種蚯蚓和人工土中的乙蟲腈對映體的超臨界流體-串聯質譜檢測方法，該方法的靈敏度、精密度、準確度均符合檢測要求，具有綠色、簡便、快捷的特點，可用于處理人工土壤和蚯蚓。蚯蚓對乙蟲腈對映體吸收具有選擇性。在3組不同濃度人工土中，蚯蚓對乙蟲腈對映體均不存在生物累積效應。但土壤中污染物濃度越大，蚯蚓體內前期累積量越大。這項工作為今后乙蟲腈的生物累積提供了基礎數據，可作為環境風險評估的參考。