Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黃抗體中和效價(jià)與攻毒保護(hù)相關(guān)性研究*

李斌，路曉，劉美麗，趙魯寧，張帆，于可響，韓易航**

（1.煙臺(tái)愛士津動(dòng)物保健品有限公司，山東 煙臺(tái) 264003；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

在家禽和野禽常見的傳染病病原中，禽腺病毒（Fowl adenvirus，F(xiàn)ADV）占據(jù)了重要地位。該病毒屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個(gè)亞群。Ⅰ亞群有A、B、C、D、E 5個(gè)種，血清型共12個(gè)[1-3]，其中血清4型禽腺病毒引起的心包積液-肝炎綜合征（又稱安卡拉病）對(duì)禽類的危害最為嚴(yán)重。1987年巴基斯坦首次報(bào)道安卡拉病，主要癥狀為嚴(yán)重的心包積液及肝臟腫大、變脆、出血或壞死。2015年該病在我國開始暴發(fā)，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-8]。

大量臨床實(shí)踐證明，抗生素、中獸藥、干擾素、轉(zhuǎn)移因子等常規(guī)藥物對(duì)安卡拉病無明顯的療效，蛋黃抗體被證明是一種有效的防控與治療手段[9-14]。本實(shí)驗(yàn)選用3批Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黃抗體，進(jìn)行抗體效價(jià)與靶動(dòng)物免疫攻毒保護(hù)效果相關(guān)性試驗(yàn)，以證明選用的中和抗體效價(jià)作為產(chǎn)品效檢標(biāo)準(zhǔn)的合理性，并為建立效檢標(biāo)準(zhǔn)和臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

21日齡SPF雞，購自濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司。

3批Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黃抗體，均由煙臺(tái)愛士津動(dòng)物保健品有限公司制備。

Ⅰ群4型禽腺病毒中和用種毒、攻毒用種毒和LMH細(xì)胞，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自賽默飛世爾；氯化鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 中和用種毒毒價(jià)的測(cè)定 將毒種用DMEM維持液作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9四個(gè)稀釋度，接種LMH傳代細(xì)胞（96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板），每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔0.1 mL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h。每日觀察，記錄CPE情況，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.3.2 攻毒用種毒半數(shù)致死量的測(cè)定 將攻毒用毒種用生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6四個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度經(jīng)皮下接種21日齡SPF雞10只，每只0.2 mL。觀察10日，記錄SPF雞死亡情況，按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)致死劑量（LD50）。

1.3.3 抗體中和效價(jià)的測(cè)定 用DMEM維持液對(duì)待檢抗體作2倍系列稀釋，取適宜稀釋度（1：128、1：256、1：512、1：1024 等）分別與中和用種毒（含200 TCID50/0.2 mL）等量混合，置37 ℃中和1 h，接種LMH傳代細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接8孔，每孔0.2 mL；同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組8孔，每孔接種同等條件處理的病毒液與DMEM維持液等量混合液0.2 mL；抗體空白對(duì)照組8孔，每孔接種同等條件處理的待檢抗體稀釋液（1：128）與DMEM維持液等量混合液0.2 mL；空白對(duì)照組8孔，每孔接種DMEM維持液0.2 mL。置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)96 h。每日觀察，記錄CPE情況。病毒對(duì)照組細(xì)胞應(yīng)全部出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、脫落等特征性病變，抗體空白對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞應(yīng)生長正常。按Reed-Muench法計(jì)算其中和抗體效價(jià)。

1.3.4 抗體的稀釋 將3批Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黃抗體進(jìn)行連續(xù)稀釋，稀釋至中和效價(jià)分別為1：64、1：128、1：256，置 4 ℃保存待用。

1.3.5 預(yù)防試驗(yàn) 取21齡SPF雞30只，隨機(jī)分為3組，每組10只。試驗(yàn)組SPF雞經(jīng)頸背部皮下注射中和效價(jià)分別為1：64、1：128、1：256的Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黃抗體，每只0.5 mL，注射抗體168 h后，接種Ⅰ群4型禽腺病毒攻毒用強(qiáng)毒0.2 mL（100LD50）。另取同批次SPF雞20只，作為攻毒對(duì)照組和健康對(duì)照組，每組各10只。攻毒對(duì)照組，不注射抗體，進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊；健康對(duì)照組，不做任何處理。觀察10日，記錄SPF雞臨床變化。共進(jìn)行3批實(shí)驗(yàn)室試制產(chǎn)品的試驗(yàn)。

1.3.6 緊急預(yù)防試驗(yàn) 取21齡SPF雞30只，隨機(jī)分為3組，每組10只。試驗(yàn)組SPF雞肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒攻毒用強(qiáng)毒0.2 mL（100LD50），36 h后將上述不同效價(jià)的抗體經(jīng)頸部皮下注射SPF雞。另取同批次SPF雞20只，作為攻毒對(duì)照組和健康對(duì)照組，每組各10只。攻毒對(duì)照組，進(jìn)行強(qiáng)毒攻擊，不注射抗體；健康對(duì)照組，不做任何處理。連續(xù)觀察10日，記錄SPF雞臨床變化。共進(jìn)行3批實(shí)驗(yàn)室試制產(chǎn)品的試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 中和用種毒的毒價(jià)

利用LMH細(xì)胞測(cè)定中和用種毒的毒價(jià)，其TCID50為 10-8.00/0.1 mL。

2.2 攻毒用種毒的半數(shù)致死量

利用21日齡SPF雞測(cè)定攻毒用種毒的半數(shù)致死量為10-4.00/0.2 mL。

2.3 抗體的中和效價(jià)

利用LMH細(xì)胞測(cè)定3批抗體的中和效價(jià)，結(jié)果顯示，3個(gè)批號(hào)的抗體中和效價(jià)分別為1：418、1：472和1：447。

2.4 抗體的預(yù)防試驗(yàn)

將3批抗體稀釋成不同中和效價(jià)后，分別注射21日齡SPF雞，168 h后進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示，當(dāng)抗體的中和效價(jià)達(dá)到1：128時(shí)，保護(hù)率均達(dá)到80%以上，攻毒對(duì)照組SPF雞100%死亡；健康對(duì)照組SPF雞100%健活（表1）。

表1 預(yù)防試驗(yàn)中不同抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)相關(guān)性

2.5 抗體的緊急預(yù)防試驗(yàn)

21日齡SPF雞先注射Ⅰ群4型禽腺病毒，36 h后注射不同中和效價(jià)的抗體，結(jié)果顯示，當(dāng)抗體中和效價(jià)為1：128時(shí)，攻毒保護(hù)率均達(dá)到80%以上；當(dāng)中和效價(jià)為1：256時(shí)，攻毒保護(hù)率均達(dá)到90%以上；攻毒對(duì)照組SPF雞100%死亡；健康對(duì)照組SPF雞100%健活（表2）。

表2 緊急預(yù)防試驗(yàn)中不同抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)相關(guān)性

3 討論

雞心包積液-肝炎綜合征對(duì)2～4周齡的肉雞危害嚴(yán)重，發(fā)病率高，死亡快，發(fā)病雞群往往未見明顯臨床癥狀時(shí)死亡率突然升高，個(gè)別雞群日死亡率可高達(dá)10%左右，整個(gè)發(fā)病周期死亡率可達(dá)60%以上。臨床數(shù)據(jù)表明，高免蛋黃抗體對(duì)該病具有顯著的預(yù)防和治療效果，但抗體的最低使用效價(jià)目前還沒有報(bào)道。為了確定Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黃抗體中和效價(jià)與攻毒保護(hù)效果的相關(guān)性，本研究將3批實(shí)驗(yàn)室試制抗體分別通過預(yù)防試驗(yàn)和緊急預(yù)防試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)行抗體中和效價(jià)與靶動(dòng)物攻毒保護(hù)力相關(guān)性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果均表明隨著抗體中和效價(jià)的升高，對(duì)SPF雞的攻毒保護(hù)率也隨之升高，即抗體中和效價(jià)與攻毒保護(hù)率呈正相關(guān)。由此，抗體中和效價(jià)測(cè)定可代替SPF雞攻毒保護(hù)試驗(yàn)，作為抗體的效檢標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)中和效價(jià)為1：128時(shí)，攻毒保護(hù)率均達(dá)到80%以上。為確保臨床效果，可將Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黃抗體效檢標(biāo)準(zhǔn)暫定為抗體中和效價(jià)不低于1：256。

本研究通過預(yù)防試驗(yàn)和緊急預(yù)防試驗(yàn)?zāi)Ｐ停M(jìn)行了Ⅰ群4型禽腺病毒蛋黃抗體中和效價(jià)與靶動(dòng)物攻毒保護(hù)力相關(guān)性試驗(yàn)，驗(yàn)證了抗體在安卡拉病的預(yù)防和緊急預(yù)防中具有良好的效果，并且確定了抗體的效檢標(biāo)準(zhǔn)和使用效價(jià)，對(duì)卵黃抗體的研發(fā)和安卡拉病的臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。