一株鵝源鴨疫里默氏桿菌1型菌株的分離鑒定與生物學特性分析

高巍

（遼寧省撫順市新賓縣農業農村局，遼寧 撫順 113200）

我國是水禽（主要是鴨和鵝等）養殖的第一大國。隨著養殖生產集約化程度的提高，多種傳染性疾病已成為阻礙水禽養殖業發展的瓶頸，其中鴨疫里默氏桿菌病是危害最大和最難控制的疾病之一。鴨疫里默氏桿菌病是鴨、鵝、火雞和其它鳥類的一種高致病性和接觸性傳染病，主要侵害1~8周齡（尤其2~3周齡）雛鴨、雛鵝及雛火雞等[1]。該病的病原為鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA），其血清型較為復雜，目前我國流行的鴨疫里默氏桿菌血清型主要以1型、2型和10型為主[2-3]。

自1904年Riemer最初發現鵝群感染鴨疫里默氏桿菌以來，該病已呈世界性分布[4]。我國研究者則于1982年首次發現北京鴨感染血清1型鴨疫里默氏桿菌[5]。目前，對于鴨疫里默氏桿菌病的診斷主要是依靠發現地的流行病學調查、發病動物群體的臨床癥狀觀察、剖檢后的病理變化分析及實驗室診斷相結合的方式。本試驗從遼寧省某疑似發生鴨疫里默氏桿菌病的規模化養鵝場采集雛鵝的腦和心臟病料12份，分離培養病原菌并進行革蘭氏染色，利用PCR方法及生化試驗進行鑒定，并對獲得的1株鴨疫里默氏桿菌進行血清型定型、耐藥性分析及致病性試驗等生物學分析，以期為今后遼寧省水禽養殖場鴨疫里默氏桿菌病的防控和治療提供臨床數據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

從遼寧省某規模化養鵝場中疑似感染鴨疫里默氏桿菌的雛鵝體內采集腦和心臟病料共計12份，患病雛鵝拉白色或綠色稀便，出現共濟失調等神經癥狀。

1.2 主要試劑

TSA固體培養基、TSB液體培養基和哥倫比亞血瓊脂培養基均購自青島海博生物技術有限公司，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，生化鑒定管購自北京陸橋技術股份有限公司，鴨疫里默氏桿菌 1、2、3、10 型陽性血清，均由東北大學提供。

1.3 鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定

對疑似感染鴨疫里默氏桿菌的雛鵝進行解剖，無菌采集病鵝的腦和心臟病料，分別劃線接種至哥倫比亞血瓊脂培養基，置于37℃、CO2培養箱培養約24～48 h。挑取平板上的單個菌落，進一步劃線至TSA固體平板上進行細菌純化培養。挑取TSA固體平板上的單菌落至TSB液體培養基中繼續培養，將擴增后的菌液涂布到載玻片上，經革蘭氏染色后在光學顯微鏡下觀察菌體的形態。根據文獻報道設計合成引物，取純化后的菌液利用16S rRNA引物進行菌液PCR鑒定[6]，引物序列見表1。同時利用生化鑒定管對獲得的菌株開展生化分析試驗。

表1 鴨疫里默氏桿菌的PCR鑒定引物

1.4 鴨疫里默氏桿菌的血清型鑒定

參照文獻[7]方法，分別用PBS緩沖液和大腸桿菌作為抗原陰性反應對照，采用玻片凝集法對分離鑒定到的鴨疫里默氏桿菌進行血清型鑒定。判定結果的方法：菌液與陽性血清混合之后3 min內出現顆粒狀凝集者為陽性，只出現輕微凝集的判為可疑，不出現凝集者為陰性。

1.5 鴨疫里默氏桿菌的藥敏試驗

按紙片法對鴨疫里默氏桿菌分離株進行15種常見藥物的敏感性分析試驗，不同藥物紙片的敏感度判斷標準參見說明書。

1.6 鴨疫里默氏桿菌的致病性試驗

在TSA平板上劃線復蘇鴨疫里默氏桿菌分離株，在37℃條件下CO2培養箱中培養24 h，將菌液離心后利用生理鹽水洗滌沉淀2次，最后用生理鹽水重懸沉淀，將菌數調整至5×109cfu/mL。將處理好的菌液經頸部皮下接種10羽7日齡雛鴨，每只注射500 μL，對照組的10羽雛鴨采用同種方式接種等量TSB液體培養基。每日觀察雛鴨的日常狀態、發病和死亡情況等，并記錄數據。

2 結果與分析

2.1 細菌分離鑒定結果

將采集的病料涂布血平板培養后，生成的白色菌落有光澤，表面光滑，半透明且邊緣整齊。分離菌株染色后經鏡檢顯示為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，以單個或成對存在，少量呈短鏈狀。利用16S rRNA基因引物鑒定菌株，均擴增出片段大小約為500 bp的目的條帶，經序列比對分析確定為鴨疫里默氏桿菌。該株鴨疫里默氏桿菌分離株的生化試驗結果顯示，觸酶試驗和脲酶試驗結果為陽性，而不同糖的微量反應試驗、吲哚試驗、MR試驗和V-P試驗等結果則均為陰性，符合鴨疫里默氏桿菌的基本生化特性。

2.2 血清型鑒定結果

血清型鑒定結果顯示，該分離株能與鴨疫里默氏桿菌1型陽性血清產生凝集，而與其它幾種血清型的陽性血清均未產生凝集，因此確定該菌株屬于血清型1型。

2.3 藥敏試驗結果

對分離得到的鴨疫里默氏桿菌經藥敏紙片法進行耐藥性分析，試驗結果如表2所示。該分離株對大環內酯類、四環素類和β-內酰胺類藥物敏感性較高，對氯霉素類藥物中敏，而對卡那霉素、鏈霉素和慶大霉素等氨基糖苷類抗生素則表現出明顯的耐藥性。

表2 鴨疫里默氏桿菌的藥敏試驗結果

2.4 致病性試驗結果

雛鴨致病性試驗結果顯示，對照組雛鴨在整個試驗過程中精神狀況和采食情況均正常且未出現死亡。試驗組的10羽雛鴨在接種24 h后開始出現發病癥狀，發病雛鴨表現出精神不振、拉黃白稀便、羽毛臟亂和采食減少等臨床癥狀，發病率為100%。試驗組雛鴨在接種36 h后開始出現死亡，共死亡8羽，死亡率達80%。以上結果證實，本試驗分離得到的這株鵝源鴨疫里默氏桿菌對雛鴨也有較強的致病性。

3 討論

鴨疫里默氏桿菌在世界各水禽養殖地區均有流行，由于其感染后的發病率和死亡率高，且近年來在我國呈上升趨勢，防控形勢愈發嚴峻，給我國水禽養殖業造成了巨大的經濟損失[8]。盡管鴨疫里默氏桿菌能夠侵害鴨、鵝等不同種類的禽類，但是在實際生產中鴨疫里默氏桿菌病疫情的暴發絕大多數見于鴨群，也使人們更多地去關注鴨群中本病流行的情況，而對鵝群的感染狀況有所忽略。近期，遼寧省內一家肉鵝養殖場出現雛鵝死亡病例，患病雛鵝表現出稀便和神經癥狀，而對病死雛鵝剖檢后的病理變化顯示，各種癥狀與鴨疫里默氏桿菌病非常相似。為了探究該養殖場雛鵝的感染情況，本試驗對死亡雛鵝進行病原學檢測，采用常規方法分離細菌病原，并對分離菌株進行血清型鑒定試驗，結果顯示，該病原菌為血清1型鴨疫里默氏桿菌。

目前臨床中對于鴨疫里默氏桿菌病多以藥物治療為主，但由于治療中抗生素的不斷濫用，鴨疫里默氏桿菌對多種抗生素產生耐藥性，其耐藥譜也越來越廣泛。文獻報道顯示，不同地區或不同分離源的鴨疫里默氏桿菌分離株對抗生素的敏感性存在差異。吳彩艷等的研究顯示，廣東地區鴨疫里默氏桿菌普遍對氟苯尼考、阿莫西林及頭孢類藥物比較敏感，而對強力霉素、環丙沙星和恩諾沙星則嚴重耐藥[9]。張燕等對安徽地區34株鴨疫里默氏桿菌分離株的耐藥性分析試驗結果顯示，這些分離株對氨基糖苷類和大環內酯類藥物耐藥性最高，對頭孢類和氯霉素類最為敏感[2]。本試驗根據藥物敏感性試驗結果分析顯示，分離株對氨基糖苷類藥物有很強的耐藥性，而對四環素類、大環內酯類和β-內酰胺類藥物則較為敏感。此外，致病性研究結果還表明，這株鵝源鴨疫里默氏桿菌對鴨也具有致病性。上述結果能為該肉鵝養殖場的鴨疫里默氏桿菌感染防治提供一定參考。