激光誘導石墨烯/酶電極的葡萄糖傳感研究

陳芳如，張兆康，2，何書涵，余羲溪，李艷霞*

（1.閩江學院 材料與化學工程學院，福建 福州 350108；2.福州大學 石油化工學院，福建 福州 350108）

隨著社會的高速發展和人類文明的進步，人們的生活水平有了極大的提高。但是環境污染與快節奏生活也導致肥胖、亞健康人群的比例不斷上升，諸如糖尿病、高血脂、心血管疾病、神經性疾病等嚴重影響了人們的日常生活。這些疾病的治療通常不是一蹴而就，需要較長的調養過程，需要對病人情況進行日常監測。譬如糖尿病，目前尚未有徹底根治的方法，患者一般需要終身檢測與治療，以控制血糖范圍，預防各類并發癥。研究表明，人體的尿液、汗液、眼淚等生物流體的葡萄糖含量與體內血糖濃度存在關聯，可用于糖尿病的血糖監測［3］。但使用傳統方法檢測患者的血液指標費時費力，給醫院和患者帶來了極大的不便，因此，對病患血糖水平的實時及非侵入式檢測顯得尤為重要［1］。

生物傳感器是一種能將電化學傳感和生物分子特異性識別相結合的傳感裝置，在當前實驗室和臨床分析各種化學和生物目標中起著關鍵作用。電化學傳感器的最終目標是構建更加簡便、靈敏和可靠的傳感界面，進一步放大檢測信號，提高靈敏度和準確度［2］。功能納米材料和納米技術的發展為改善電化學傳感器性能提供了新的可能，尋找高性能電極材料是制備優異電化學傳感器的關鍵。隨著納米材料對高性能的器件需求日益增加，可控微納結構的研究成為熱點之一［4］。可控微納結構的制備，重點在于微納加工技術的應用，使其朝著簡化制備工藝、低成本和高重復性的方向發展，激光微加工的廣泛應用，極大地提高了加工效率和重復性，為下一代智能健康檢測提供了新思路。

石墨烯是一種單原子層的二維sp2雜化碳納米片，由于其大比表面積、高電子遷移率、熱導率、生物相容性、超低密度和機械柔性，從而表現出優異的理化性能，并在傳感器、樣品前處理和超級電容器等領域得到廣泛應用［5－6］。激光誘導石墨烯（LIG）技術可誘導聚酰亞胺（PI）襯底直接生成三維多孔結構的石墨烯，表現出大比表面積和高導電性，制備過程無需高溫和溶劑，在柔性電極制備中應用廣泛［7－8］。另外，作為最典型的嵌入式系統，較小體積的微電極使得電化學分析便攜、快速，更利于實際應用［9－10］。

葡萄糖氧化酶（GOx）因具有重要的催化活性而被廣泛研究，其價格低廉，穩定性好，實用性強，也是制備酶傳感器的理想模型分子［11］。鑒于酶的高選擇性和高催化活性特點，目前GOx法是市場上使用最多的血糖檢測方法，然而該工作的難點在于將酶固定在所需的平臺上。GOx通常被固定在覆蓋薄氟錫氧化物或銦錫氧化物、金或玻碳電極等剛性基底表面，阻礙了其在人體上的應用。LIG電極因其良好的物生物相容性，以及作為酶的良好環境和促進電子轉移而被廣泛開發［12］。電化學和激光相結合可為GOx在石墨烯基質中的共價鍵合以及GOx的電子轉移提供良好環境，在葡萄糖監測方面顯示出較好潛力，尤其在非侵入性和無痛性方面［13］。本文通過設計三電極圖案，結合LIG技術制備微型柔性石墨烯電極，利用1?芘丁酸的疏水端苯環與石墨烯的六元環結構的π－π疊加效應，對LIG電極表面工作區域羧基化，進而共價交聯GOx，通過采用便攜式電化學工作站、計時電流分析法，記錄在恒定電壓下GOx催化葡萄糖產生的電流信號與葡萄糖濃度的關系，所制備的酶電極可用于人體血清、尿樣和汗液的葡萄糖檢測，從而構建了基于GOx的高靈敏、高選擇葡萄糖傳感，進一步推進便攜、綠色、低成本生物傳感器的研制。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Nano Pro－Ⅲ型激光打印機，配連續半導體激光器，波長450 nm，輸出功率5.5 W（天津嘉銀納米科技有限公司）用于LIG電極制備；便攜式電化學工作站（sensit/BT，雷迪美特中國有限公司）。

聚酰亞胺（PI）膜（厚度0.08 μm，天津嘉銀納米科技有限公司）；導電銀漿（深圳市奧斯邦股份有限公司）；Ag/AgCl漿（廣州市銀標貿易有限公司）；氯化鉀（99.5）、鐵氰化鉀（99.5）、亞鐵氰化鉀（99.5）、葡萄糖（分析純）、50%戊二醛（福州鑫裕華實驗儀器有限公司）；葡萄糖氧化酶（GOx，150 U/mg）、人工汗液、人工尿液、胎牛血清（源葉生物科技有限公司）；1-芘丁酸（上海麥克林生化科技股份有限公司，98%）、牛血清白蛋白（BSA，98.0%）、磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.0）（北京鼎國生物科技有限公司）。

1.2 電極的制備

1.2.1LIG電極的制備 將PI膜緊密粘貼于PET柔性基底上，Nano Pro－Ⅲ激光打印機與電腦連接，設計三電極圖案，設置激光相對強度為35%，雕刻深度為20%，激光打印石墨烯圖案，打印的電極依次用乙醇、水淋洗，室溫晾干。在石墨烯尾部（三電極端頭）涂上導電銀漿，參比電極末端涂上Ag/AgCl漿，聚二甲基硅氧烷（PDMS）固定工作區域面積，放入培養皿中蓋好，靜置，固化，得LIG電極，待用。

1.2.2LIG/芘丁酸電極的制備 于LIG電極工作區域，滴加3 μL 5 mmol/L 1-芘丁酸（簡寫為芘丁酸）的乙酸溶液，均勻分散，靜置1 h，依次用乙酸、乙醇、水淋洗電極，室溫下晾干，得到LIG/芘丁酸電極，使電極表面羧基化。

1.2.3LIG/GOx電極的制備 配制質量濃度為4 mg/mL GOx和2 mg/mL BSA的PBS溶液（0.1 mol/L，pH 7.0），作為GOx溶液。于LIG/芘丁酸電極工作區域，先用2 μL乙醇浸潤，半干（減小表面張力），再滴加10 μL GOx ?0.5%戊二醛混合溶液（7∶3，體積比），4 ℃活化過夜，純水淋洗，晾干備用，制得LIG/GOx電極，于培養皿中密閉，儲于冰箱備用。

1.3 葡萄糖電化學傳感分析

取所制備的LIG/GOx電極，從低到高移取100 μL系列濃度葡萄糖溶液，對電極進行i~t掃描。每次更換溶液，需要用高一級濃度的溶液潤洗電極3遍，恒定0.7 V電位下進行掃描，每個濃度計時80 s，得i~t曲線。

2 結果與討論

2.1 電極制備及葡萄糖傳感

LIG/GOx電極制備及葡萄糖傳感分析過程示意圖如圖1所示，具體過程包括：A：激光直寫三電極圖案化石墨烯；B：制備LIG電極；C：自組裝1-芘丁酸；D：戊二醛共價鍵合GOx；E：計時電流分析。

圖1 葡萄糖傳感分析示意圖Fig.1 Schematic of glucose sensing analysis

在室溫條件下使用連續半導體激光器，將聚酰亞胺（PI）襯底改性為具有高導電性的三維多孔石墨烯結構［14］，無需使用高溫工藝、溶劑或后續處理。其基本原理是通過激光照射，將sp3碳原子光熱轉化為sp2碳原子［15］。激光照射產生的能量導致晶格振動，產生較高的局域溫度，從而破壞碳氧鍵、碳氧鍵和氮碳鍵，芳香族化合物重新排列形成多層石墨結構。結合圖案化設計，可制備特定圖案的石墨烯電極。芘丁酸疏水端的4個苯環相連的芘結構，與石墨烯的碳六元環結構通過π－π疊加效應，穩定結合在石墨烯電極表面，另一端的親水端羧基通過戊二醛共價交聯葡萄糖氧化酶，經BSA封閉，得到LIG/GOx電極［16－18］。

2.2 電極材料的表征

采用掃描電子顯微鏡（SEM）對LIG和LIG/芘丁酸復合電極進行表征（圖2）。可觀察到LIG電極表面呈現3D介孔的空間網狀結構，且分散均勻、質地緊密（圖2A），表明石墨烯電極具有較大的比表面積。LIG/GOx復合電極（圖2B）仍然保留完整的介孔結構，說明在GOx修飾過程中，電極表面形貌未被破壞，同時石墨烯膜層增厚，表明石墨烯表面富含的羧基通過與戊二醛共價交聯，將葡萄糖氧化酶成功固定到電極上。用透射電子顯微鏡（TEM）對激光直接制備的石墨烯納米材料進行表征，可觀察到石墨烯的多層片狀結構（圖2C）及LIG薄片的波紋狀結構以及晶格條紋（圖2D），這些波紋結構的形成歸因于激光輻射產生的表面熱膨脹，證明采用本方法的激光誘導技術，可一步生成石墨烯。

圖2 LIG電極（A）和LIG/GOx復合電極（B）的SEM圖及LIG石墨烯材料的TEM圖（C、D）Fig.2 SEM images of graphene electrode（A） and LIG/GOx composite electrode（B） and TEM images of LIG graphene materials（C，D）

采用EDS光譜分析LIG和LIG/GOx復合電極表面的C、N、O元素成分。圖3A所示，LIG電極表面C、N、O元素的相對含量分別為93.22%、1.44%和5.34%，說明LIG電極表面主要由C組成，含極少量的N和O，修飾GOx后（圖3B），C、N和O元素的含量分別為88.32%、4.92%和6.76%，其O含量明顯增加，這是由于GOx富含氧元素，證明GOx成功修飾到LIG電極表面。

為進一步表征電極表面GOx的共價修飾情況，采用Nicolet is50紅外光譜儀，將樣品壓在衰減全反射ATR附件上，對LIG和LIG/GOx電極工作區域界面進行紅外全反射光譜分析。結果如圖3C所示，LIG電極表面未見明顯紅外吸收峰，而LIG/GOx電極表面可觀察到許多特征紅外吸收峰，其中3 287 cm?1處對應O—H、N—H伸縮振動，2 930 cm?1處對應飽和碳上的C—H伸縮振動，1 314 cm?1附近指紋峰對應飽和碳上的C—H面內彎曲振動，1 640 cm?1處對應酰胺鍵的伸縮振動，1 142 cm?1對應C—O—C（酯）的反對稱伸縮振動，1 081、1 002 cm?1處對應C—O鍵的伸縮振動，這些特征峰的出現，表明GOx已成功修飾至LIG電極表面。

進一步采用賽默飛DXR智能拉曼光譜儀對LIG的形成進行表征，結果如圖3D所示。可觀察到3個典型的石墨烯指紋振動峰，分別為1 575 cm?1處的G帶、1 345 cm?1處的D帶和2 679 cm?1處的2D帶。D帶和2D帶分別為六方碳結構sp2雜化的初級面內振動和二階面內振動，而G帶則與sp2雜化的C—C鍵拉伸模式有關。D帶和G帶之間的強度比（ID/IG）接近1，表明石墨烯結構存在缺陷。

圖3 LIG、LIG/GOx電極表面的EDS 光譜（A、B）與紅外光譜（C），LIG石墨烯材料的拉曼光譜（D）Fig.3 EDS spectra（A，B） and infrared spectra（C） of LIG and LIG/GOx electrode surfaces，and Raman spectrum of LIG graphene materials（D）

2.3 電極的電化學活性

采用鐵氰化鉀溶液的循環伏安（CV）圖觀察電極的組裝過程，從圖4A可以看出，LIG電極有明顯的氧化還原峰。當芘丁酸修飾LIG電極后，氧化峰正移，還原峰負移，響應電流明顯下降，這是由于芘丁酸屬于小分子基團，導電性能差，對電極表面的電子轉移有明顯的阻礙作用。LIG/GOx電極的峰電流進一步減小，表明GOx已成功修飾至電極表面。LIG/芘丁酸電極能充分固定GOx，促進GOx電活性中心與電極表面之間的電子轉移，同時保留了GOx的生物活性，給予GOx直接進行電化學行為的微環境。GOx修飾的LIG電極的CV曲線圖仍然具有較明顯的氧化還原峰，說明LIG/GOx電極表面仍具有良好的導電性及電化學響應。

圖4 LIG、LIG/芘丁酸、LIG/GOx滴加鐵氰化鉀溶液（A）及LIG、LIG/GOx滴加PBS和葡萄糖溶液（B）的循環伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of LIG，LIG/pyrene butyric acid，and LIG/GOx in potassium ferricyanide solution（A），LIG and LIG/GOx in PBS and glucose solution（B）

采用CV法進一步考察LIG、LIG/GOx電極在PBS和葡萄糖溶液中的電化學行為。由于GOx作為識別元件對葡萄糖具有較高的選擇性，圖4B顯示LIG/GOx電極比LIG電極在葡萄糖溶液中具有更好的電化學響應，說明GOx在電化學反應過程中對葡萄糖起到了酶催化效果。

參照文獻［19］，電極表面的有效面積（Aef）f可根據Randles－Sevcik方程計算：Ip=2.69 ×105Aeffn2/3D01/2C0ν1/2。式中，n指參與氧化還原過程中電子傳遞數（n= 1，K3［Fe（CN）6］溶液），D0指鐵氰化鉀溶液的擴散系數（0.673 × 10?5cm2/s），C0指氧化還原媒介質的體相濃度（5 × 10?6mol/cm3K3［Fe（CN）6］），v為電位掃描速率，Ip為氧化峰電流（A）。通過公式，結合圖4A的CV曲線，計算出LIG、LIG/芘丁酸、LIG/GOx、LIG/GOx（BSA）電極的Aeff值依次為0.222、0.090、0.048、0.028 cm2，表明LIG電極經芘丁酸、GOx以及BSA修飾后，電極表面產生較大影響，其氧化還原峰電流逐步降低，有效面積逐步減小。

單位面積修飾物的負載量（Γ，mol/cm2）通過Faraday公式計算：Ip=nFQv( 4RT)=n2F2AΓv( 4RT)和Γ=Q(nFAeff)，式中，Q為CV曲線的氧化峰面積積分，R為氣體常數，T為溶液絕對溫度，n指參與氧化還原過程中電子傳遞數（n= 1），F指法拉第常數（F = 96 493 C/mol）。通過公式和結合圖4A，計算出LIG/芘丁酸，LIG/GOx電極表面修飾物質的Γ值分別為2.48 × 10?9、3.42 × 10?9mol/cm2，從而計算出被固定在電極表面單位面積GOx的數量為9.4 × 10?10mol/cm2。

2.4 電位對電流信號的影響

為比較葡萄糖氧化酶在不同電位的電化學響應，參考文獻［18，20］并根據圖4B的CV曲線，選擇0.5、0.6、0.7 V 3個恒定電位進行比較。以PBS緩沖液作為基底液，在3個恒定電位下，每隔80 s依次從低到高對不同濃度的葡萄糖溶液進行計時電流掃描。結果顯示，隨著電壓的增加，LIG/GOx電極對葡萄糖的靈敏度隨之增加，且在0.7 V時對葡萄糖的電流響應最顯著、靈敏度最高（圖5A），其優異性可能與葡萄糖氧化酶的催化活性及穩定性有關。實驗選擇0.7 V作為LIG/GOx測試萄萄糖的最佳工作電位。

葡萄糖氧化酶在氧分子存在下能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖內酯酸。圖5B為經N2除氧和不除氧條件下，LIG/GOx對葡萄糖溶液的i~t曲線圖。結果顯示，不除氧條件下，LIG/GOx的計時電流信號隨葡萄糖濃度的增加而顯著增加，而脫氧情況下其計時電流變化不大，表明此時GOx對葡萄糖的生物電催化氧化效果不明顯。據文獻報道［21］，推測GOx在LIG/GOx電極表面可能發生如下電化學反應：

圖5 LIG/GOx在不同電位（A）和脫氧環境下（B）對葡萄糖的i ~ t曲線圖Fig.5 i－t curves of LIG/GOx in glucose solution at different potentials（A） and deoxygenation（B）glucose concentration（from left to right）：0，5.0 × 10?5，1.0 × 10?4，5.0 × 10?4，1.0 × 10?3，2.5 × 10?3，5.0 × 10?3，1.0 × 10?2 mol/L

即氧化態葡萄糖酶（GOx（FAD））將葡萄糖氧化為葡萄糖內酯酸，同時還原態酶GOx（FADH2）將溶液中氧氣還原為過氧化氫。在含氧條件下，反應（1）和（2）同時發生；在脫氧條件下，具有生物活性的GOx（FAD）發生反應（1），GOx（FADH2）在修飾電極上發生直接電子轉移反應（反應（3），這也是無氧條件下，計時電流具有一定信號響應，但信號強度隨濃度變化不大的原因。

2.5 工作曲線

在0.7 V電位下，以PBS緩沖液作為基底液，每隔80 s對不同濃度（5.0 × 10?5、1.0 × 10?4、5.0 ×10?4、1.0 × 10?3、2.5 × 10?3、5.0 × 10?3、1.0 ×10?2mol/L）葡萄糖溶液依次進行掃描，采用計時電流法考察LIG、LIG/GOx電極對葡萄糖的響應（圖6）。結果顯示，與LIG相比，LIG/GOx對葡萄糖的響應迅速，且隨著體系中葡萄糖濃度的增加，響應電流呈階梯式增長，說明LIG/GOx電極對葡萄糖具有極高的親和力和酶催化活性。

將不同濃度所得計時電流值與葡萄糖濃度對數作工作曲線（圖6），可以看出：LIG/GOx的電流響應與葡萄糖濃度的對數呈指數關系，葡萄糖溶液檢測的動態范圍為5.0 × 10?5~ 1.0×10?2mol/L，其檢測范圍寬于常規血糖儀（羅氏卓越精采血糖儀的檢測范圍為0.6 ~ 33.3 mmol/L，三諾GA－3血糖儀的檢測范圍為1.1 ~ 33.3 mmol/L）。通過逐步降低葡萄糖溶液濃度，測得檢出限（S/N= 2）為5.0 × 10?5mol/L。說明LIG/GOx電極對葡萄糖檢測具有較靈敏的電流響應，而LIG電極對葡萄糖基本無響應，證明GOx在電化學反應中對葡萄糖起到定向催化作用。

圖6 LIG、LIG/GOx電極對濃度葡萄糖溶液的i ~ t曲線圖Fig.6 i－t curves of LIG and LIG/GOx in different glucose concentrations glucose concentration（from left to right）：0，5.0 × 10?5，1.0 × 10?4，5.0 × 10?4，1.0 × 10?3，2.5 × 10?3，5.0 × 10?3，1.0 × 10?2 mol/L；insert：the calibration curves

將本方法與幾種報道的葡萄糖電化學生物傳感器進行比較（見表1）。結果顯示，本方法所構建的傳感器具有較寬的檢測范圍和較好的靈敏度，且電極易于制備、環境友好、成本低廉，具有良好的應用前景。

表1 電化學葡萄糖傳感方法的比較Table 1 The comparison of electrochemical sensor for detection of glucose

2.6 電極性能

選取濃度均為1 mmol/L的酒石酸、蔗糖、半乳糖、乳糖酸和葡萄糖等小分子樣品，采用計時電流法分析其在修飾電極上的電化學響應情況。實驗顯示，只有葡萄糖表現出顯著的電流響應，而酒石酸、蔗糖、半乳糖、乳糖酸等均表現出微弱的電流響應。表明半乳糖等干擾物對葡萄糖的檢測干擾較小，LIG/GOx電極對葡萄糖傳感具有良好的選擇性。

在優化實驗條件下，采用同一LIG/GOx電極連續測定5次，隨著使用次數的增加，電流曲線呈緩慢下降趨勢，但仍具有較好的電流強度，表明該LIG/GOx電極具有良好的重復性。

對同一批次5個LIG/GOx電極進行i ~ t掃描。結果表明，濃度為1.0 × 10?4、1.0 × 10?3、5.0 ×10?3mol/L的葡萄糖溶液的相對標準偏差（RSD）分別為7.7%、6.8%、5.0%，說明該LIG/GOx電極具有良好的精密度。

在相同條件下，將LIG/GOx電極在冰箱4 ℃下放置8 d，分別在第1、2、4、8 d進行測定，并記錄i~t曲線。隨著電極放置時間的延長，電流響應呈緩慢下降趨勢，但仍有較好的電流表現，說明放置一定時間，GOx損失不顯著，該LIG/GOx電極具有較好的穩定性和使用壽命。

2.7 LIG/GOx電極的柔性

考察了該電極在卷曲狀態下的電化學性質。采用平鋪和卷曲狀態（圖7內插圖）下LIG/GOx電極對高、中、低3種濃度的葡萄糖溶液進行i~t曲線掃描（圖7）。結果顯示，兩種狀態下，i~t曲線接近重合，說明LIG/GOx電極在一定卷曲程度下，仍保留良好的電化學響應，卷曲后不影響使用［26］。表明所制備的LIG/GOx電極具備一定的柔性。

圖7 柔性LIG/GOx電極在不同彎曲狀態下的i ~ t曲線Fig.7 i－t curves of the flexible LIG/GOx electrode under different crimping conditions

2.8 實際樣品的測定

選取用PBS稀釋1倍的人工尿液、人工汗液，稀釋20倍的胎牛血清的作為生物樣品，分別添加低、中、高3種不同濃度的葡萄糖溶液，進行i ~ t掃描，并計算加標回收率。由表2可知，尿液、血清、汗液樣品中葡萄糖的回收率依次為73.0% ~97.8%、103% ~ 144%、79.1% ~ 104%，其中血清樣品的加標回收率偏高，但仍在可接受范圍，說明本方法能較好地用于尿液、血清、汗液等生物樣品中葡萄糖的檢測。

表2 不同生物樣品中葡萄糖的加標回收率Table 2 Spiked recoveries of glucose in different biological samples

3 結 論

本文采用LIG技術制備柔性LIG電極，通過GOx的共價修飾，構建了一種葡萄糖生物傳感器。選擇靈敏的計時電流法研究了葡萄糖在GOx修飾電極的電化學行為。結果表明，LIG/GOx電極在0.7 V恒定電位下，其響應電流在5.0 × 10?5~ 1.0 × 10?2mol/L范圍內隨葡萄糖濃度的增加而增加，對葡萄糖表現出較高的選擇性和靈敏度，良好的穩定性和重復性，且具有一定柔性。基于LIG電極的葡萄糖檢測成本低廉，操作簡便，可用于實際樣品分析，并賦予這類傳感器的非臨床和無創檢測功能，同時也為葡萄糖的便攜式檢測開拓了新思路，具有很好的應用前景。