海洋弧菌對(duì)青島近岸滸苔暴發(fā)的響應(yīng)研究?

蘇蒙帥，梁金昌，于淑賢，張曉華,2,3??

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，深海圈層與地球系統(tǒng)前沿科學(xué)中心，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3.中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島 266003)

弧菌(Vibrio)屬于變形菌門(Proteobacteria)γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)，是一種典型的海洋異養(yǎng)細(xì)菌，一般條件下占海洋總細(xì)菌的1%左右[1]。以往的研究顯示，弧菌是一種機(jī)會(huì)主義細(xì)菌，當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，會(huì)出現(xiàn)暴發(fā)性的增殖[2]，當(dāng)營養(yǎng)缺乏或生存環(huán)境不適時(shí)，又能進(jìn)入活的非可培養(yǎng)(Viable but nonculturable，VBNC)狀態(tài)，增強(qiáng)自身對(duì)不利環(huán)境條件的抗性，從而等待適合其生存的環(huán)境條件[3-4]。Rubio-Portillo等[5]的研究顯示，在地中海區(qū)域不同地理位置，附著于石珊瑚表面的弧菌群落結(jié)構(gòu)也是不同的?？膳囵B(yǎng)弧菌群落與珊瑚的健康狀況有關(guān)，健康珊瑚表面的弧菌豐度是不健康珊瑚的5倍多。Thickman等[6]發(fā)現(xiàn)浮游植物來源的溶解有機(jī)物(Dissolved organic matter，DOM)顯著地增加了總副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和致病性V.parahaemolyticus的豐度。Armada等[4]在長期實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到了弧菌具有呼吸作用，證明弧菌可以在資源有限的條件下存活?；【梢栽跔I養(yǎng)條件充足時(shí)暴發(fā)性增殖又能在環(huán)境條件不利時(shí)增強(qiáng)自身抗性的生存策略，使它們能夠適應(yīng)各種各樣的海洋環(huán)境。研究這種獨(dú)特的生存策略對(duì)了解海洋生物地球化學(xué)循環(huán)具有重要的意義。

2007年至今，中國黃海沿岸地區(qū)每年夏季都會(huì)暴發(fā)滸苔(Ulvaprolifera)綠潮，給當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境造成了影響，甚至演變成一種自然災(zāi)害[7]。作為黃海沿岸北部城市的青島，每年夏季也會(huì)受到滸苔暴發(fā)的影響。滸苔暴發(fā)對(duì)海洋水質(zhì)的影響是巨大的。滸苔暴發(fā)初期會(huì)大量吸收海水中的營養(yǎng)物質(zhì)，例如氮、磷等營養(yǎng)鹽[8]。滸苔消退時(shí)，會(huì)大量沉入海底進(jìn)行有氧分解，消耗大量的氧氣，釋放出大量的營養(yǎng)物質(zhì)等，導(dǎo)致水中的溶解氧含量下降，對(duì)需氧生物尤其是異養(yǎng)微生物的呼吸產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[9]。因此，藻類暴發(fā)影響了海洋中相關(guān)區(qū)域DOM的含量和種類，而異養(yǎng)細(xì)菌又可以利用和轉(zhuǎn)化相應(yīng)的DOM，使其成分和生物活性等方面發(fā)生變化。滸苔等浮游植物與海洋微生物之間的這種相互作用，影響了海洋的生物地球化學(xué)循環(huán)。

關(guān)于滸苔等浮游植物與微生物群落之間關(guān)系的研究已有報(bào)道。例如Liang等[10]在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室模擬培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)滸苔來源的DOM促進(jìn)總細(xì)菌和弧菌豐度在24 h達(dá)到峰值，群落出現(xiàn)明顯的演替規(guī)律。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)有滸苔生長的海水池塘中黃桿菌豐度較高，弧菌豐度較低。Zhang等[12]的研究表明在有滸苔生長的海水中脫硫弧菌(Desulfovibrio)等細(xì)菌占主導(dǎo)地位。然而目前并沒有針對(duì)滸苔暴發(fā)整個(gè)過程中海洋細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的研究，尤其是缺乏對(duì)滸苔分解物響應(yīng)最快的弧菌的研究。本研究擬在自然條件下對(duì)滸苔暴發(fā)前、中、后期弧菌群落進(jìn)行研究。結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)弧菌的豐度和群落組成進(jìn)行研究，確定弧菌在此過程中的豐度變化趨勢(shì)及其群落演替規(guī)律。另外，本研究還將對(duì)影響弧菌群落的環(huán)境因子進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據(jù)歷年青島近岸滸苔暴發(fā)的情況，選取三個(gè)典型的滸苔暴發(fā)地點(diǎn)(見圖1，棧橋ZQ、魯迅公園LX、第二海水浴場(chǎng)EY)，于2017年4—8月進(jìn)行了14次海水取樣。其中EY站點(diǎn)為廣闊沙灘，沒有大型巖石和草木的覆蓋，較易受到人類影響；ZQ站點(diǎn)受到人為設(shè)計(jì)的景點(diǎn)阻隔，兼有沙灘和巖石等；LX站點(diǎn)多為大型巖石和草木，受到人為影響較小。三個(gè)站點(diǎn)生態(tài)環(huán)境不同，在一定程度上可以作為青島近岸的代表，且均無城市廢水排放管道等明顯的非自然因素影響。取樣時(shí)間涵蓋本次滸苔暴發(fā)的全過程，可分為暴發(fā)前、中、后三個(gè)時(shí)間段。在采水現(xiàn)場(chǎng)使用200 μm孔徑的篩絹預(yù)過濾海水，以除去顆粒較大的雜質(zhì)。將濾過的海水通過漏斗轉(zhuǎn)入5 L預(yù)先酸處理過的聚碳酸酯桶(Thermo Fisher Scientific，USA)中。用YSI多參數(shù)水質(zhì)儀(YSI 556 MPS，美國)在現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量海水的溫度、鹽度、電導(dǎo)率、總?cè)芙庑怨腆w(TDS)、pH、溶解氧(DO)等理化指標(biāo)。

(ZQ：棧橋；LX：魯迅公園；EY：第二海水浴場(chǎng)。ZQ: Zhanqiao; LX: Luxun Park; EY: The Second Bathing Beach.)

樣本用采樣地點(diǎn)+采樣月份+采樣次數(shù)進(jìn)行編號(hào)。其中：采樣地點(diǎn)用其名稱的前兩個(gè)漢字首字母進(jìn)行樣品的命名；第一個(gè)數(shù)字表示采樣的月份；第二個(gè)數(shù)字表示采樣的次數(shù)。例如：LX41表示在魯迅公園4月份的第一次采樣。

根據(jù)本次滸苔來臨和最后消退的時(shí)間，將樣品分為三組：滸苔暴發(fā)前(Before，樣品41、42、51、52、53、54、61)，滸苔暴發(fā)中(During，樣品62、63、64、65、66、71、72)，滸苔消退后(After，樣品73、74)。

1.2 樣品預(yù)處理

DNA樣品預(yù)處理：將1 L海水用3 μm孔徑的聚碳酸酯膜(Millipore Corporation，Billerica，MA，直徑47 mm；PC膜)過濾，再將過濾后的海水用0.22 μm孔徑的PC膜過濾。使用后的濾膜均放入2 mL無菌凍存管，然后立刻放入液氮中速凍并轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。具體方法參照Liang等[10]的方法。

溶解有機(jī)碳(Dissolved organic carbon, DOC)樣品預(yù)處理：將100 mL水樣用預(yù)處理(酸洗，550 ℃灼燒6 h)過的專用過濾器過濾至玻璃纖維膜(Whatman，0.7 μm，5 mm)上。取過濾后水樣大約40 mL至棕色玻璃瓶，為防止微生物干擾加一滴飽和HgCl2溶液。迅速放于-20 ℃保存。具體方法參照Zhang等[34]的方法。

葉綠素樣品預(yù)處理：樣品處理須在黑暗中進(jìn)行，必須在2 h內(nèi)完成。將500 mL水樣于黑暗中用3 μm聚碳酸酯膜進(jìn)行過濾，過濾后的水樣再用0.22 μm膜進(jìn)行過濾。將濾膜放入錫箔紙包裹的2 mL凍存管并放入液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存。具體方法參照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)》GB17378.4—1998。

1.3 環(huán)境因子的測(cè)定

溶解有機(jī)碳(DOC)：溶解有機(jī)碳的測(cè)定由中國海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王旭晨教授課題組協(xié)助。采用高溫催化氧化法通過島津TOC-V全有機(jī)碳分析儀(日本京都島津公司)測(cè)定[15]。

葉綠素：測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)參照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)》GB17378.4—1998。過濾完海水的3和0.22 μm的聚碳酸酯膜分別加入80%的丙酮(10 mL)，混勻后在4 ℃放置14～24 h。使用熒光分光光度計(jì)測(cè)量酸化前后的熒光值。Chla的濃度計(jì)算參考以下公式：

式中：FD為換算因子；R為酸化因子；Rb為酸化前熒光值；Ra為酸化后熒光值；v為丙酮體積(mL)；V為海水體積(L)。

1.4 可培養(yǎng)弧菌豐度的測(cè)定

將海水樣品梯度稀釋后，涂布于TCBS培養(yǎng)基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium)上，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行，于28 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 DNA的提取

樣品DNA的提取采用酚/氯仿/異戊醇法。具體方法：將濾膜放于冰上融化，剪碎后放入2 mL樣品管中。加入600 μL sodium chlorideTris-EDTA(STE)溶液并用均質(zhì)破碎儀震蕩(6 m/s，60 s，3次)，加速裂解。加入10 μL的10 mg/mL溶菌酶并37 ℃水浴0.5 h，加入60 μL 10%的SDS溶液混勻，再加入6 μL 10 mg/mL蛋白酶并65 ℃水浴20 min。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)離心(12 000 r/min，10 min)，再吸取上清加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)離心(12 000 r/min，10 min)并重復(fù)2次。上清用0.6倍體積異丙醇在-20 ℃沉降2 h或過夜，再次離心(14 000 r/min，4 ℃，10 min)。用70%乙醇沖洗離心管內(nèi)壁后晾干。用無菌蒸餾水或Tris-EDTA(TE)溶解DNA，-20 ℃保存。

1.6 弧菌和細(xì)菌16SrRNA基因豐度的測(cè)定

樣品中的弧菌和細(xì)菌16S rRNA基因豐度的定量，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)技術(shù)。所用引物序列見表1。

表1 本研究所用的PCR引物序列

反應(yīng)參數(shù)、反應(yīng)體系和標(biāo)準(zhǔn)品的制備參考Liang等的方法[19]。將標(biāo)準(zhǔn)菌接入含有Ampicillin抗性的LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani培養(yǎng)基)，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。用質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit Ⅰ(Takara)提取含有目的基因的質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，切膠回收后獲得qPCR標(biāo)準(zhǔn)品。用NanoDrop 2000 Spectrophotometer(Thermo Scientific，USA)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)設(shè)置3個(gè)平行，以無菌去離子水為模板設(shè)置三個(gè)空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)操作系統(tǒng)StepOne Real-time PCR System，分析軟件StepOne(version2.2)。

1.7 弧菌16S rRNA基因高通量測(cè)序

DNA樣品送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)弧菌16S rRNA基因的V2～V4高變區(qū)擴(kuò)增。測(cè)序平臺(tái)Illumina MiSeq，擴(kuò)增引物為169F和680R。所用引物序列見表1，反應(yīng)參數(shù)、反應(yīng)體系參考Liang等[19]的方法。

1.8 數(shù)據(jù)分析

將原始數(shù)據(jù)按最小樣品序列數(shù)進(jìn)行抽平，保留序列數(shù)總和≥3的物種。運(yùn)用QIIME1軟件過濾低質(zhì)量序列和去除嵌合體，獲得有效序列，使用UPARSE(v7.1)對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類，相似度為97%。通過RDP分類器算法對(duì)16S rRNA基因序列進(jìn)行分類學(xué)分析，閾值為70%。對(duì)抽平后的樣本重新命名，以便進(jìn)行后續(xù)分析。進(jìn)行Pan/Core物種分析，根據(jù)生成的曲線是否平緩，評(píng)估測(cè)序量是否足夠。所有樣品根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆纸M，設(shè)計(jì)分組方案。

按照滸苔暴發(fā)的不同時(shí)期進(jìn)行分組。用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行顯著性差異分析。通過Spearman秩和檢驗(yàn)分析弧菌和細(xì)菌與環(huán)境因子的相關(guān)性。通過α多樣性分析反映滸苔暴發(fā)過程中弧菌的多樣性和豐富度。α多樣性分析包括Phylogenetic distance、Chao 1、Shannon、Equitability四個(gè)指數(shù)，按照滸苔暴發(fā)的不同站點(diǎn)和暴發(fā)時(shí)期進(jìn)行分組。利用非度量多維尺度(Non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析來探索組間群落組成的相似性或差異性。進(jìn)行群落組成分析，通過Bar圖可視化樣本的物種豐度。通過Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)分析優(yōu)勢(shì)弧菌的豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性。最后進(jìn)行冗余分析研究弧菌群落與主控環(huán)境變量之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 滸苔暴發(fā)和消亡期間的環(huán)境參數(shù)變化

(小寫字母表示顯著性差異分析，相同字母代表兩者沒有顯著性差異，不同的字母代表有顯著性差異。Lowercase letters represent significant difference analysis.The same letters represent no significant difference between the two, and different letters represent significant differences.)

2.2 可培養(yǎng)弧菌、總弧菌和總細(xì)菌豐度的變化

可培養(yǎng)弧菌與總弧菌的豐度隨采樣時(shí)間呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，在7月的第二次采樣(采樣點(diǎn)72)時(shí)間點(diǎn)附近達(dá)到峰值，滸苔消退后略有下降(見圖3A、B)。可培養(yǎng)弧菌豐度在滸苔暴發(fā)前先短暫下降，之后迅速上升，其平均值為76.17 CFU/mL，而在整個(gè)暴發(fā)過程中趨于穩(wěn)定，約2 131.32 CFU/mL?？偦【呢S度在滸苔暴發(fā)過程中變化趨勢(shì)明顯(2.65×103～1.71×106copies/mL)，在滸苔暴發(fā)前先短暫上升，再迅速下降，暴發(fā)前豐度為4.19×104copies/mL。在71采樣時(shí)間點(diǎn)附近出現(xiàn)短暫的豐度減小(1.12×104copies/mL)，后迅速上升到最高值(8.09×105copies/mL)。因此，滸苔暴發(fā)對(duì)總弧菌群落的影響主要發(fā)生在暴發(fā)末期?？赡苁怯捎跐G苔裂解導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)迅速釋放，為弧菌生長提供了營養(yǎng)條件。

總細(xì)菌的豐度在滸苔暴發(fā)過程中變化趨勢(shì)較為穩(wěn)定，呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)(見圖3C)，并介于3.38×105和1.58×107copies/mL之間。滸苔消退后，總細(xì)菌的豐度達(dá)到最低值1.32×106copies/mL。在總弧菌豐度顯著上升的情況下，總細(xì)菌豐度卻無明顯變化，這使弧菌在細(xì)菌中的占比從小于1%上升至20.54%，表明滸苔暴發(fā)的確影響了弧菌群落的豐度，造成了細(xì)菌群落的演替，弧菌代替其他類群成為了重要組成。滸苔消退后，弧菌的豐度又恢復(fù)到暴發(fā)前水平，表明群落演替再次發(fā)生。

對(duì)三個(gè)采樣點(diǎn)的可培養(yǎng)弧菌、總弧菌、總細(xì)菌比較分析發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)的采樣時(shí)間點(diǎn)，ZQ的豐度總是最高的。EY和LX在弧菌與細(xì)菌的豐度上無顯著性差異。在弧菌豐度達(dá)到峰值時(shí)(72采樣點(diǎn))，EY與ZQ的豐度高于LX，兩者差別很小。

(A：可培養(yǎng)弧菌；B：總弧菌；C：總細(xì)菌；D：豐度與環(huán)境因子的關(guān)系。Spearman秩和檢驗(yàn)。Vibrio-F、Vibrio-P分別為自由生活和附著生活的弧菌；Bacteria-F、Bacteria-P分別為自由生活和附著生活的細(xì)菌；Cultural為可培養(yǎng)弧菌。*：P<0.05; **：P<0.01；***：P<0.001。橢圓向左為負(fù)相關(guān)，向右為正相關(guān)。A: Culturable Vibrio; B: Total Vibrio; C: Total bacteria; D: Relationship between abundance and environmental factors.Spearman’s rank correlation test.“Vibrio-F” and “Vibrio-P” are free-living and particle-associated Vibrio respectively, “Bacteria-F” and “Bacteria-P” are free-living and particle-associated Bacteria respectively, and “Cultural” is culturable Vibrio.*：P < 0.05; **：P < 0.01; ***：P < 0.001.The ellipse has a negative correlation to the left and a positive correlation to the right.)

2.3 弧菌群落結(jié)構(gòu)的變化及其影響因素分析

2.3.1 弧菌的多樣性和豐富度 48個(gè)樣品共獲得1 836 819條序列，抽平后每個(gè)樣品獲得21 781條序列。樣品的coverage均在99.9%以上，可以確定這些序列能夠代表所有樣品中的弧菌。將樣品按照滸苔暴發(fā)的時(shí)間和采樣站位進(jìn)行分組，可看出滸苔暴發(fā)與弧菌豐富度無顯著相關(guān)性(見圖4A、B)，但是暴發(fā)前后的均勻度與多樣性指數(shù)有顯著差異(t檢驗(yàn)，P<0.05，見圖4C、D、G和H)。從站位方面看，ZQ站點(diǎn)的豐富度和系統(tǒng)發(fā)育距離明顯高于其余兩個(gè)站點(diǎn)(P<0.05，見圖4E、F)。

圖4 滸苔暴發(fā)過程中弧菌的多樣性和豐富度指數(shù)變化

基于OTU水平進(jìn)行NMDS分析，弧菌按照滸苔暴發(fā)前、暴發(fā)時(shí)、消退后沿第一軸進(jìn)行聚類(見圖5，Stress=0.148)，根據(jù)采樣站點(diǎn)沒有明顯的聚類。表明滸苔暴發(fā)極大地影響了弧菌的群落組成，造成群落間顯著差異(ANOSIM，R2=0.43，P<0.001)。

(用不同的顏色區(qū)分滸苔暴發(fā)時(shí)期，用不同的形狀區(qū)分不同樣品地點(diǎn)。Samples of different periods of Ulva prolifera bloom are color-coded and samples of different sampling sites are distinguished by shapes.)

2.3.2 弧菌的群落分析 滸苔暴發(fā)過程中弧菌群落組成發(fā)生顯著變化(見圖6、7A)。對(duì)弧菌群落中優(yōu)勢(shì)種分析結(jié)果顯示，V.splendidus(P<0.001)、V.gigantis(P<0.001)和V.pectenicida(P<0.05)隨采樣時(shí)間延長呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，滸苔暴發(fā)前、后的占比存在顯著差異。其中V.splendidus是弧菌群落中豐度最高的種，滸苔暴發(fā)前豐度為76.40%。V.campbellii(P<0.001)、V.caribbeanicus(P<0.01)和V.maritimus(P<0.01)隨采樣時(shí)間延長豐度不斷升高。其中V.campbellii在滸苔消退后在弧菌群落中占比最高。V.comitans(P<0.01)、Photobacteriumrosenbergii(P<0.05)和V.pelagius(P<0.001)在滸苔暴發(fā)時(shí)占比最高，消退后略有下降。

圖6 滸苔暴發(fā)過程中的弧菌群落組成

(A：部分優(yōu)勢(shì)弧菌類群在不同階段的占比，圖中只展示有顯著性差異的物種，Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，*：P<0.05; **：P<0.01；***：P<0.001。B：弧菌豐度與環(huán)境因子的關(guān)系。A: Proportion of some dominant Vibrio groups in different stages, only species with significant differences are shown，Kruskal Wallis rank sum test，*：P<0.05; **：P<0.01; ***：P<0.001.B: Relationship between Vibrio abundance and environmental factors.)

圖8 冗余分析說明弧菌群落與主控環(huán)境變量之間的關(guān)系

3 討論

3.1 滸苔暴發(fā)對(duì)弧菌豐度的影響

先前的研究表明，弧菌是一種典型的機(jī)會(huì)主義細(xì)菌，當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，會(huì)發(fā)生暴發(fā)性的增殖[20]。尤其一些浮游動(dòng)植物的暴發(fā)會(huì)緊跟著弧菌的暴發(fā)增殖。例如，Thickman等[6]發(fā)現(xiàn)浮游植物來源的DOM顯著地增加了總V.parahaemolyticus和致病性V.parahaemolyticus的豐度。Sison-Mangus等[21]發(fā)現(xiàn)隨著擬菱形藻暴發(fā)進(jìn)入峰值，弧菌的豐度從6%增加到65%，且其豐度與浮游植物生物量呈現(xiàn)正相關(guān)。Main等[22]發(fā)現(xiàn)附著生活的弧菌同赤潮異彎藻、甲藻的豐度顯著正相關(guān)。同樣的在本次研究中，滸苔暴發(fā)期總弧菌與可培養(yǎng)弧菌豐度均出現(xiàn)顯著性升高。尤其是在滸苔暴發(fā)末期(71～72)，弧菌豐度從1.12×104copies/mL迅速增加至8.09×105copies/mL，總弧菌對(duì)細(xì)菌的占比也從不到1%增加到11.3%左右。以往的研究可知，弧菌具有較短的代時(shí)，例如需鈉弧菌(V.natriegens)的代時(shí)低于10 min[23]，這可能與弧菌有較高的核糖體基因拷貝數(shù)有關(guān)，能夠較快地進(jìn)行增殖[24]。另外，弧菌能夠在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的情況下生存，這與它們對(duì)有機(jī)碳化合物代謝譜廣有關(guān)。它們可以通過分泌一系列的胞外酶而去利用很多大分子的有機(jī)物例如褐藻膠等，還可以直接利用很多小分子物質(zhì)[25]。同時(shí)，弧菌通過自身的趨化作用尋找營養(yǎng)物質(zhì)，一旦其生長的某種限制因子得到補(bǔ)充，又可以暴發(fā)性增殖[26-27]。

在滸苔暴發(fā)整個(gè)過程中，相比于暴發(fā)前期弧菌豐度的略微升高，暴發(fā)末期，豐度顯著性升高，推測(cè)這與暴發(fā)末期滸苔大量裂解而導(dǎo)致的營養(yǎng)物質(zhì)大量釋放有關(guān)。Liu等[28]的研究表明，滸苔上附著生活著很多細(xì)菌，其中弧菌是優(yōu)勢(shì)類群之一。因此，滸苔暴發(fā)過程中，由于其豐度的迅速增加，為附著生活的弧菌提供了足夠多的生態(tài)位。暴發(fā)末期，滸苔大量裂解[12]，釋放出大量的營養(yǎng)物質(zhì)如氮、磷等營養(yǎng)鹽，同時(shí)釋放出大量的DOM。這些DOM大多由滸苔多糖和蛋白質(zhì)組成，其中小分子DOM被細(xì)菌直接利用，大分子DOM在細(xì)菌分泌的胞外酶作用下降解為小分子再被利用。因此附著生活的弧菌轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂缮顮顟B(tài)，利用這些營養(yǎng)物質(zhì)迅速增殖。以往的研究證實(shí)了這樣的結(jié)果，Liu等[28]在對(duì)青島膠州灣滸苔暴發(fā)所引起的細(xì)菌群落改變的研究中發(fā)現(xiàn)，藻類暴發(fā)末期甚至開始消退時(shí)弧菌目對(duì)總細(xì)菌相對(duì)占比達(dá)到最大。Teeling等[29]關(guān)于海洋中浮游植物繁殖對(duì)浮游細(xì)菌的群落演替的研究中發(fā)現(xiàn)，直到浮游植物暴發(fā)的消退期，γ變形菌綱的細(xì)菌如弧菌的豐度才開始迅猛增加。因此可以得出結(jié)論：滸苔等藻類對(duì)弧菌豐度的影響主要集中在暴發(fā)的末期，也可能是由于暴發(fā)末期是浮游植物死亡釋放大量營養(yǎng)物質(zhì)的時(shí)期。

3.2 滸苔暴發(fā)對(duì)弧菌群落的影響

Diner等[33]在美國南加州圣迭戈長達(dá)一年的時(shí)間里每月對(duì)霍亂弧菌(V.cholerae)，V.parahaemolyticus，創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們的豐度都很高，但是特定物種分布對(duì)應(yīng)于特定的溫度和鹽度。本次研究也能得出多種弧菌與溫度呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。例如，夏季海水溫度升高了15 ℃，隨著滸苔暴發(fā)，弧菌群落的優(yōu)勢(shì)種發(fā)生很大的變化。滸苔暴發(fā)前期，占比最大的是V.splendidus，其相對(duì)豐度高達(dá)76.40%。隨著采樣時(shí)間的增加，溫度逐漸變高，V.splendidus卻呈現(xiàn)一種減小的趨勢(shì)。而V.campbellii相反，隨著溫度的升高而增加，并成為暴發(fā)后期的主要類群。同樣的，V.gigantis隨水溫升高而降低，V.caribbeanicus隨水溫升高而增加。Liang等[19]在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，中國北部邊緣海的V.campbellii和V.caribbeanicus在夏季的豐度大于水溫較低的冬季，本研究結(jié)果同該結(jié)論一致，即在滸苔暴發(fā)過程中以V.campbellii和V.caribbeanicus為代表的溫水物種逐漸成為弧菌群落的優(yōu)勢(shì)類群。

3.3 關(guān)于DOM與弧菌群落的關(guān)系

4 結(jié)語