高通量測序結合傳統微生物培養研究醬醪中微生物多樣性及群落變化

伍亞龍，楊愷，史莓梅，呂鵬軍，汪冬冬，李龍，唐垚，張其圣,*

1(四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山，620030) 2(四川省食品發酵工業研究設計院有限公司，四川 成都，611130)

醬油是一種發源自我國的傳統釀造調味品，又稱“醬汁”或“清醬”，距今已有2 500多年歷史，深受人們喜愛[1]。醬油發酵是一個半開放的混菌共同發酵體系，參與的微生物主要是米曲霉、酵母菌和乳酸菌。乳酸菌和酵母菌是制曲和發酵過程中從環境中帶入的微生物，微生物種群是醬油的發酵和風味物質合成的重要影響因素之一[2]。醬醪發酵是醬油制作中最重要的階段之一，在醬油釀造中起到關鍵作用。醬醪發酵階段主要是以酵母菌和乳酸菌為主進行液體發酵，這個階段生成大量的醇類、酯類和酚類物質以及芳香族化合物，賦予醬油特殊的香氣[3-4]。

目前微生物多樣性的研究方法主要分為傳統可培養方法和免培養方法。傳統可培養方法是最常見的研究方法之一，利于了解分離純化得到的微生物的形態特征和生理特性[5]。YAN等[6]利用傳統微生物培養法對日本醬油發酵過程中微生物變化分析得出乳酸菌為優勢菌群，其次為酵母菌和霉菌。隨著分子生物學的進步，免培養技術逐漸趨于成熟。近年來利用免培養技術研究醬油(醪)發酵過程中微生物多樣性的報道明顯增多，謝顯華[7]利用變性梯度凝膠電泳技術對3個月發酵周期的醬油細菌群落結構演變規律進行了分析，發現魏斯氏菌屬為優勢菌屬。WANG等[8]使用宏基因組學研究醬油中細菌群落多樣性，發現醬醪階段存在34個細菌屬，其中以庫特菌屬、葡萄球菌屬和腸球菌屬為優勢菌。阮志強等[9]采用高通量測序研究醬油發酵過程中真菌群落結構變化及優勢真菌，整個發酵過程優勢菌為曲霉屬、柯達酵母屬和結合酵母屬。

目前國內外對醬油(醪)發酵大多采用單一分析方法對微生物多樣性進行研究，或是針對細菌或真菌的群落結構動態變化研究其與風味物質的相關性。但是，鮮有使用傳統可培養技術和免培養技術結合的方法探索醬醪發酵過程中細菌及真菌群落結構和多樣性的研究。本研究采用高通量測序技術和傳統可培養技術結合的手段，對醬醪在發酵過程中細菌和真菌群落的動態變化進行研究，解析不同時期醬醪中主要微生物群落的構成，為企業提高醬油品質及醬醪發酵時間的調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 樣品采集

利用無菌袋分別對發酵時間為0、1、2、3、4、5、6個月的醬醪進行取樣，樣品采用高鹽稀態釀造工藝，四川清香園調味品有限公司。

1.1.2 實驗試劑

Bacterial DNA Isolation Kit，2× PCR Mix，成都福際生物技術公司；Biomiga EZgene TM Fungal gDNA Miniprep Kit，美國Biomiga；PCR引物，成都擎科梓熙生物技術有限公司；無水乙醇，成都市科龍化工有限公司；瓊脂糖，北京索萊寶科技有限公司；MRS培養基、高鹽MRS培養基(含100 g/L食鹽)、孟加拉紅培養基和PDA培養基均現配現用，其他試劑均為分析純。

1.1.3 實驗設備

T960梯度PCR熱循環儀，杭州晶格科學儀器有限公司；JY04S-3E凝膠成像系統，北京君意東方電泳設備有限公司；DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀，北京市六一儀器廠；THZ-C-1臺式恒溫振蕩器，江蘇太倉實驗設備廠；DHP-9080B恒溫培養箱，上?，槴\實驗設備有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，江蘇蘇凈集團有限公司；ABI GeneAmp?9700 PCR儀，美國應用生物系統公司；TGL-20BR臺式高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；DNP-9162電熱恒溫培養箱，長沙精開儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 醬醪中微生物計數

將1 mL醬醪加入到9 mL質量濃度8.5 g/L無菌生理鹽水中，按照10倍梯度稀釋，并選取合適的稀釋度和培養基，將0.1 mL稀釋液注入90 mm培養皿中，采用涂布法分別對乳酸菌和酵母菌活菌計數。非嗜鹽乳酸菌選擇MRS培養基(添加30 g/L納他霉素)，嗜鹽乳酸菌選擇高鹽MRS培養基(含100 g/L食鹽)，待涂布完畢后，置于37 ℃恒溫培養箱中，培養24～48 h后進行計數；酵母菌選擇孟加拉紅培養基，置于28 ℃恒溫培養箱中，培養48～72 h后計數。

1.2.2 醬醪中微生物的分離、純化

非嗜鹽乳酸菌：在乳酸菌計數平板中，按菌落形態差異(形狀、顏色、大小、凸起度、干濕度、透明度、邊緣完整性)挑選菌落于MRS平板上劃線，并記錄該菌株在平板上的相似菌株數量。將菌株反復純化3～4次后，進行革蘭氏染色與接觸酶試驗，篩選出革蘭氏陽性、接觸酶陰性的無芽孢純培養物；將篩選出的菌株接入MRS液體培養基，并在37 ℃恒溫培養箱中培養18～24 h，然后與甘油溶液以體積比1∶1加入甘油管中(甘油最終體積分數20%)，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

嗜鹽乳酸菌：選用添加食鹽(100 g/L)的MRS培養基進行嗜鹽乳酸菌計數。按相同步驟進行稀釋涂布后，于30 ℃下培養6～7 d進行計數。分離純化，鏡檢后，將篩選出的菌株接入MRS液體培養基，并在37 ℃恒溫培養箱中培養18～24 h，然后與甘油溶液以體積比1∶1加入到甘油管中(甘油最終體積分數20%)，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

酵母菌：將計數平板中挑選的單菌落(按形狀、顏色等培養特征)進行3～4次劃線分離純化，于PDA培養基上純化。將純化后的菌株進行形態描述并進行鏡檢，觀察是否有雜菌，若有，則還需進一步劃線分離，直至為純培養物。將純化后的菌株接種PDA液體培養基中28 ℃培養24～36 h后，將菌液按體積比1∶1加入到已滅菌的甘油管中(甘油最終體積分數20%)，放入-80 ℃超低溫冰箱保藏。

1.2.3 細菌16S rDNA分析

使用細菌通用引物27F和1492R對16S rDNA全長進行基因擴增，擴增后的PCR產物由成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序，采用雙向測序法，即每株菌得到2條800～1 000 bp的片段。利用BLAST進行比對，尋找基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。從美國國家生物技術信息中心(NCBI)上查找到相關細菌模式菌株16S rDNA序列，利用Mega 5.0軟件將測序的菌株與模式菌株序列多重對比后進行系統進化親緣關系研究，采用鄰接法構建系統發育樹。

1.2.4 真菌26S rDNA分析

采用NL1和NL4引物擴增26S rDNA片段，PCR擴增后的產物由成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序，將測序后的結果利用BLAST進行比對，尋找基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種；從NCBI的GenBank中查找代表性序列，將其與測序序列進行多重對比后作系統進化親緣關系研究，利用軟件Mega 5.0構建系統發育樹。

1.2.5 高通量測序分析

樣品的高通量測序采用上海美吉生物醫藥科技有限公司MiSeq測序平臺，按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，將所有優化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，16S細菌使用Silva數據庫，ITS真菌使用Unite真菌數據庫進行比對。最后采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并統計每個樣品的群落組成[10]。

2 結果與分析

2.1 醬醪發酵過程中微生物菌變化分析

在醬醪發酵過程中，米曲霉通常在發酵初期由人工接種，第0月時高達108CFU/mL，但其在醬醪發酵1個月時就已消失，主要是其產生的蛋白酶參與后續發酵。醬醪中酵母菌和乳酸菌主要由環境帶入，故其發酵初期含量較高[11]。如圖1所示，發酵第0月時，非嗜鹽乳酸菌含量達到108CFU/mL，發酵第0～1月數量急劇下降，可能是醬醪中鹽含量較高，導致體系中非嗜鹽乳酸菌迅速死亡[12]；發酵第1～4月，非嗜鹽乳酸菌數量下降緩慢，可能是由于總酸上升，pH下降，抑制了非嗜鹽乳酸菌的生長；發酵第5月時非嗜鹽乳酸菌已消失。酵母菌發酵初期數量遠低于乳酸菌，只有106CFU/mL左右，隨著發酵的進行，數量下降，但在發酵第5月和第6月時略有升高。同非嗜鹽乳酸菌相比較，嗜鹽乳酸菌在發酵初期數量較少，但發酵1個月時，數量驟增至108CFU/mL，而后嗜鹽乳酸菌數量逐漸減少，但在發酵后期仍是醬醪中的優勢微生物菌群，發揮主要作用，這與ZHANG等[13]的研究結果一致，并且嗜鹽乳酸菌和酵母菌存在于整個醬醪發酵過程。

圖1 醬醪發酵過程中微生物菌相變化Fig.1 Microbial phase changes during soy sauce fermentation

2.2 傳統可培養方法鑒定醬醪發酵過程中的非嗜鹽乳酸菌

2.2.1 非嗜鹽乳酸菌分離鑒定

從醬醪發酵各階段的樣品中分離純化得到非嗜鹽乳酸菌共計42株。測序結果通過BLAST軟件在GenBank數據庫中比對，比對結果見圖2。

圖2 非嗜鹽乳酸菌系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of non-halophilic lactic acid bacteria

通過比對乳酸菌的16S rDNA序列和構建系統發育樹發現，JY1R1等與模式菌株Pediococcuslolii/acidilactici的序列非常相近，同源性非常高，因此將其鑒定結果記為Pediococcuslolii/acidilactici；同理，JY1R5等菌株鑒定為Lactobacillusacidipiscis/pobuzihi，JY1R2等菌株鑒定為Enterococcussp.，JY0R6鑒定為Leuconostocpseudomesenteroides，JY0R13等菌株鑒定為Weissellacibaria，JY0R4鑒定為Weissellathailandensis，JY0R2鑒定為Weissellaparamesenteroides/hellenica。

2.2.2 醬醪發酵過程中非嗜鹽乳酸菌群落結構以及數量變化

如圖3所示，醬醪發酵過程中，前期乳酸菌種類較后期豐富，發酵初期，Weissella比例較高，W.thailandensis，W.paramesenteroides/hellenica，W.cibaria/confusa相對豐度較高，也有一部分Leuconostocpseudomesenteroides/mesenteroides存在。發酵第1月時，Weissella和Leuconostoc均消失，Enterococcus相對豐度最高，其次是P.lolii/acidilactici，L.acidipiscis/pobuzihi也存在；發酵2～4月，僅存在L.acidipiscis/pobuzihii和Enterococcus，而L.acidipiscis/pobuzihii相對豐度遠高于Enterococcus。醬醪發酵5個月之后，未分離鑒定到非嗜鹽乳酸菌。

圖3 可培養方法中非嗜鹽乳酸菌群落結構Fig.3 Community structure of non-halophilic lactic acid bacteria in culturable medium

如圖4所示，Weissella在醬醪發酵初期，數量高達5×107CFU/mL，但在發酵第1月時就已消失，可能原因是這類菌株對高鹽環境較為敏感；P.lolii/acidilactici僅出現在醬醪發酵第1個月，數量約7×103CFU/mL，發酵第2個月時就已消失。Enterococcus和L.acidipiscis/pobuzihii為醬醪發酵中期的主要乳酸菌，發酵2月時數量達到最大值，隨后開始下降；發酵第1月時，Enterococcussp.數量高于L.acidipiscis/pobuzihii；發酵2～4月，L.acidipiscis/pobuzihii數量則比Enterococcus高1個數量級。醬醪發酵5～6月非嗜鹽乳酸菌消失。

圖4 可培養技術優勢非嗜鹽乳酸菌的數量變化Fig.4 Quantitative changes of dominant non-halophilic lactic acid bacteria in culturable medium

2.3 傳統可培養方法鑒定醬醪發酵過程中的酵母菌

2.3.1 醬醪發酵酵母菌分離鑒定

從醬醪發酵各階段的樣品中分離、純化后得到酵母菌共計24株，測序結果通過BLAST軟件在GenBank數據庫中比對，比對結果見圖5。

圖5 酵母菌系統發育樹Fig.5 Yeast phylogenetic tree

通過比對酵母菌的26S rDNA序列和構建系統發育樹發現，JY2F1、JY1F4與Debaryomyceshansenii，Debaryomycesvindobonensis，Debaryomycessubglobosus等有效菌株序列同源性都較高，系統發育樹聚為一支，故鑒定為Debaryomycessp.；JY0F2鑒定為Candidatropicalis；JY1F1鑒定為Saccharomycescerevisiae；JY1F5鑒定為Zygosaccharomycessp.；JY0F3鑒定為Pichiakudriavzevii；JY0F1鑒定為Candidacatenulata；JY1F2鑒定為Rhodotorulamucilaginosa；JY2F2鑒定為Candidaapicola；JY1F3鑒定為Starmerellasp.。

2.3.2 醬醪發酵過程中酵母菌群落結構

如圖6所示，酵母菌存在于醬醪發酵的整個過程，剛入池發酵時存在P.kudriavzevii、C.tropicalis、C.catenulate3種酵母，其中P.kudriavzevii相對豐度最高，P.kudriavzevii被發現普遍存在于果酒等傳統發酵食品中，是異戊醇、乙酸乙酯等風味化合物的主要來源之一[14]。發酵第3月和第6月時Debaryomyces也占有較高的豐度，ZHANG等[15]發現D.hansenii僅通過蛋氨酸分解代謝產生揮發性硫化合物，能賦予醬醪特殊的風味。發酵1～6月，Starmerella的豐度都很高，為整個醬醪發酵過程的優勢真菌屬；而R.mucilaginosa、Zygosaccharomyces、S.cerevisiae、C.apicola等可能是發酵前期環境中偶然出現的菌種，在隨后的發酵中消失。

圖6 酵母菌群落結構Fig.6 Yeast community structure

2.4 高通量測序解析醬醪發酵過程中主要優勢微生物

2.4.1 樣品細菌序列信息和α多樣性分析

利用MiSeq對醬醪發酵過程中樣品進行測序，根據測序比對結果，7個樣品中含有454 470條序列，共得到838個OTUs。如表1所示，7個樣品的Coverage均在99.9%以上，說明樣品覆蓋率較高。Chao1指數和Ace代表物種豐富度，而Shannon度量表示觀察到的OTU豐度，其能同時反映豐富度和均勻度[16]。其中，樣品JY2的Ace指數和Chao 1指數最高，分別為155和161，說明發酵第2月時細菌物種豐富度最高；樣品JY3的OTU指數和Shannon指數最高，分別為138和2.55，說明發酵第3月時細菌多樣性最高。由此可見，不同發酵階段樣品之間的微生物多樣性以及物種豐度有一定程度的差異。醬醪發酵初期物種相對豐富，多樣性呈現明顯的下降趨勢，到第1月時物種豐富度和多樣性到達最低值，隨后在發酵第2月開始升高并且恢復到較高水平，表明細菌群落適應了發酵環境并處于動態平衡。

表1 不同樣品中α細菌多樣性指數Table 1 Alpha diversity index of bacterial community in different samples

2.4.2 細菌多樣性分析

如圖7所示，從門水平看，樣品包含7個門，其中糖精細菌門(Saccharibacteria)、Spirochaetae豐度較低，不是醬醪發酵的優勢菌群，而厚壁菌門(Firmicutes)占總序列的比例達到了94.04%，是優勢菌群。

a-門；b-屬圖7 醬醪發酵過程中細菌群落在門和屬水平上的結構變化Fig.7 Changes of bacterial communities at phylum and genus levels during soy sauce fermentation

從屬水平看，樣品包含86個屬，其中四聯球菌屬(Tetragenococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)為醬醪發酵中優勢菌屬，分別占總序列的41.55%和25.84%，Tetragenococcus的豐度呈現先增長后下降的趨勢，且在4個月時最高，占64.43%。而Weissella在0個月時占28.65%，相對豐度較高，其后隨著發酵的進行，有減少趨勢，這與文獻報道一致[17-18]。OGASAWARA等[19]的研究中發現Tetragenococcus與堿性蛋白酶或風味蛋白酶結合，能夠提高揮發性物質和游離氨基酸的含量以提升醬醪的風味，TRAN等[20]的研究指出，Weissella在醬醪發酵過程中能產生一些有機酸，例如乙酸，以增加醬醪的特殊風味。值得注意的是，Lactobacillus在發酵2個月、3個月時豐度增高，分別為15.03%和15.69%，其后又急減，幾乎消失，原因可能是由于大多數Lactobacillus對高鹽環境耐受性低所致。

2.4.3 樣品真菌序列信息和α多樣性分析

如表2所示，利用MiSeq測序方法對醬醪發酵過程中樣品進行測序，根據測序比對結果，7個樣品中含有237 086條序列，共得到104個OTUs。7個樣品的coverage均在99%以上，說明樣品覆蓋率較高。樣品真菌群落的Ace指數和Chao1指數呈現波動變化且逐漸降低，可能是由于隨著醬醪發酵的進行，發酵前期帶入的環境真菌中有部分不適應高鹽環境而逐漸消亡，耐鹽真菌開始生長繁殖所致。Shannon指數和Simpson 指數同樣呈現出相似的動態變化規律。結合圖1真菌數量變化，發酵前期霉菌急劇減少，酵母菌也呈現先下降后呈平穩的趨勢，說明前期開始生長的耐鹽真菌逐步成為優勢菌，而不耐鹽真菌則出現消亡，真菌數量處于動態平衡，但物種多樣性降低。

2.4.4 真菌多樣性分析

如圖8所示，從門水平看，Ascomycota(子囊菌門)占總序列的99.83%，為優勢菌群。WEI等[21]所檢測出的真菌種類皆屬于Ascomycota，與本研究結果相似。從屬水平看，Aspergillus0個月時相對豐富度很高，此時人工接種的米曲霉剛入發酵池；其后在發酵過程中逐漸減少，直至幾乎消失。而Starmerella相對豐度逐漸增高，在發酵3月、4月時最高，到6月又降低，此時未有分類信息的環境微生物占據了62.75%。Candida的豐富度也呈現先增后降的趨勢，但規律不是很明顯。其余菌屬占比較少，無規律可循。從整個發酵過程中可以看出Starmerella為優勢菌屬。目前鮮有文獻對醬油發酵過程中的Starmerella

a-門；b-屬圖8 醬醪發酵過程中細菌群落在門和屬水平上的結構變化Fig.8 Changes of fungi communities at phylum and genus levels during soy sauce fermentation

進行報道，SULAIMAN等[22]用鳥槍宏基因組方法分析馬來西亞的中國傳統醬油廠0～6個月的醬醪中微生物變化，發現真菌主要為Candida、Starmerella和Wickerhamiella，而其中Candida為優勢菌屬。值得一提的是，本研究是首次發現Starmerella在醬醪中作為優勢真菌屬，其在醬醪發酵過程中的作用特性有待進一步探索。

3 結論

應用Illumina Miseq高通量測序和傳統可培養相結合的手段研究醬醪不同發酵階段微生物群落結構變化及優勢菌群，從而揭示醬醪發酵過程中微生物的演替規律，得出以下結論：

(1)基于可培養方法，可將整個醬醪發酵過程分為3個時期。0～1月為發酵前期，此間，霉菌逐漸消亡，非嗜鹽乳酸菌含量最高，約108CFU/mL，種類也比較豐富，其中魏斯氏菌屬(Weissellasp.)數量較高，認為啟動了發酵；2～4個月為發酵中期，乳酸菌種類和數量逐漸減少，其中腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和四聯球菌屬(Tetragenococcus)為優勢菌；5～6個月為發酵后期，非嗜鹽乳酸菌逐漸消亡，嗜鹽乳酸菌和酵母菌成為主要菌群。

(2)高通量測序也可得到相似的結果，醬醪中細菌包含7個門86個屬，其中，四聯球菌屬(Tetragenococcus)占總序列的41.55%，魏斯氏菌屬(Weissella)占25.84%，葡萄球菌屬(Staphylococcus)占16.81%，乳桿菌屬(Lactobacillus)占5.04%。因此，Tetragenococcus和Weissella在醬醪發酵中為優勢細菌屬。醬醪中真菌主要為子囊菌門(Ascomycota)，屬水平上以Starmerella、Candida和Aspergillus為主。從整個發酵過程中可以看出Starmerella為優勢菌屬。當前對以Starmerella為優勢真菌的報道幾乎沒有，其在醬醪發酵過程中的作用特性也不得而知，有待進一步研究。

通過掌握醬醪中微生物的演替規律，探究不同發酵階段微生物菌群與揮發性風味物質、氨基酸、有機酸等理化指標的相關性。實際醬油生產中可通過人工添加乳酸菌、酵母菌等對發酵過程進行調控，從而達到提高醬油風味和品質的目的。