利口葡萄酒混濁物結構及其蛋白組分鑒定分析

李雯，陳彥雄，趙圓圓，李蔚，張珍*，杜建明，張生祥，王麗

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅祁連葡萄酒業有限公司，甘肅 張掖，734000)

根據國際葡萄與葡萄酒組織的規定，利口葡萄酒是由葡萄汁(包括部分發酵的葡萄汁)經添加蒸餾酒等原料調配而成的一種酒精度在15% vol～22% vol的特種葡萄酒，其酒體含有一定的蛋白質、酚類、果膠等大分子物質及其絡合物，貯藏和運輸過程中容易發生混濁或者輕微的沉淀現象[1]，導致消費者對產品質量產生質疑，很大程度上阻礙了利口葡萄酒產業的良好發展。

近年來，許多研究者已對白葡萄酒混濁的可能原因進行了分析報道。研究發現，蛋白質可能導致葡萄酒膠體不穩定，形成無定型沉淀物或絮凝物，并在裝瓶前或裝瓶后產生懸浮和不良的混濁物，是造成白葡萄酒不穩定的主要因素[2]。相關報道[3-5]顯示，類甜蛋白(VVTL1)亞型是白葡萄酒混濁形成的主要因素；干白葡萄酒不穩定主要是酒體中類甜蛋白作用的結果，蛋白質穩定時其二級結構是二硫鍵、α-螺旋和β-折疊；幾丁質酶會產生更高水平的聚集，是導致白葡萄酒出現不穩定現象的主要蛋白。課題組前期試驗表明，以‘賽美蓉’葡萄品種為原料，通過酒精發酵釀造‘賽美蓉’白葡萄酒后，添加‘賽美蓉’葡萄汁、‘白玉霓’白蘭地以及‘貴人香’冰酒調配得到的利口葡萄酒經長期放置后產生了輕微的混濁現象，導致利口葡萄酒品質下降，影響了利口酒的感官質量[6]。然而，目前關于以白葡萄品種為原料生產的利口葡萄酒中混濁物的研究鮮有報道，尤其對利口葡萄酒混濁物結構及蛋白組分的研究尚未見報道。

因此，本文研究了利口葡萄酒陳釀6個月后混濁物的形態與結構、主要成分及其蛋白組成，旨在探究引起利口葡萄酒混濁的主要蛋白種類，為解決利口葡萄酒混濁問題提供理論參考，以促進利口酒產業的發展，為消費者提供更優質的產品。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

‘賽美蓉’葡萄(糖度24.6 Brix°)，于2020年采自祁連的葡萄酒業種植基地；‘白玉霓’白蘭地(酒精度51% vol)，甘肅省葡萄酒產業技術研發中心；‘貴人香’冰酒(酒精度9% vol)，祁連葡萄酒業公司。

乙腈(ACN，質譜級)，Fisher Chemical公司；甲酸(FA，質譜級)、NH4HCO3(質譜級)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT，分析純)、碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA，分析純)、三氟乙酸(trifluoroacetic adic,TFA，分析純)，Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶(測序級)，Promega公司；總糖和還原糖檢測試劑盒(DNS比色法)，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

Easy-nLC 1200毛細管高效液相色譜儀、Q Exactive電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Concentrator plus真空離心濃縮儀，德國Eppendorf公司；H-1850R臺式高速冷凍離心機，湘潭湘儀儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 利口葡萄酒的釀制

1.3.1.1 利口葡萄酒生產工藝

‘賽美蓉’葡萄→挑選→破碎→添加SO2→添加果膠酶→除去沉淀→添加膨潤土→降溫澄清→過濾→裝罐→接種酵母→酒精發酵→終止發酵→陳釀→調配→貯藏→取樣分析

1.3.1.2 ‘賽美蓉’葡萄酒釀造

挑選成熟度一致的‘賽美蓉’葡萄除梗破碎后，向葡萄汁中均勻添加60 mg/L SO2(以亞硫酸鈉計)和35 mg/L果膠酶，迅速降溫，于10 ℃靜置8 h。澄清后分離沉淀，并加入600 mg/L膨潤土，在2 ℃條件下繼續靜置4 d后，分離沉淀。以0.2 g/L添加量接種釀酒酵母，(20±1) ℃條件下進行酒精發酵，發酵結束后將發酵基酒于14～16 ℃陳釀1～2個月。

1.3.1.3 利口葡萄酒配制

參考丁凱等[6]優化的調配參數，以‘賽美蓉’白葡萄酒、‘白玉霓’白蘭地、‘貴人香’冰酒、和‘賽美蓉’葡萄汁為原料，配制‘賽美蓉’利口葡萄酒。

1.3.2 利口葡萄酒混濁物的分離

利口葡萄酒低溫貯藏6個月，2 296×g離心10 min，用冷凍干燥機將離心后的沉積物干燥，密封并儲存在-20 ℃條件下，進行檢測分析。

1.3.3 利口葡萄酒混濁物形貌和結構表征

1.3.3.1 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察

將少量混濁物凍干粉分散在樣品座上，用離子濺射儀鍍金60 s，通過SEM觀察混濁物在不同倍數下的表面形貌。

1.3.3.2 X射線衍射(X ray diffraction,XRD)分析

采用XRD對混濁物物相結構進行測定分析，掃描范圍10～80°；掃描速度1°/min；掃描步長0.01。

1.3.3.3 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析

采用FT-IR對混濁物化學結構進行測定分析，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.4 利口葡萄酒混濁物成分測定

參考WU等[7]的方法并略做修改。將0.02 g混濁物溶于10 mL 5 mmol/L NaOH溶液中，并在搖床中120 r/min培養20 min，使用1 mol/L HCl溶液調整pH至(7.0±0.2)，分析其成分。

1.3.4.1 混濁物中蛋白含量的測定

參考BRADFORD[8]的方法，采用考馬斯亮藍法進行測定。

1.3.4.2 混濁物中總酚含量的測定

參考王華[9]的方法，采用Folin-Ciocalteu比色法進行測定。

1.3.4.3 混濁物中總糖含量的測定

參考總糖和還原糖檢測試劑盒(DNS比色法)測定。

1.3.5 利口葡萄酒混濁物蛋白分離鑒定

1.3.5.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳

將混濁物凍干粉溶解于ddH2O，取V(樣本)∶V(加載緩沖液)=1∶5混合，沸水中加熱5 min后，將樣品和marker加入質量分數12%分離膠的孔中，蓋上頂蓋，連接電極。電壓設定為80 kV，運行15 min，隨后將電壓設定為120 kV，繼續運行15 min。取下膠板，將剝離膠浸入考馬斯亮藍染液中，室溫下染色1 h，添加脫色液，放入搖床(80 r/min)進行脫色，每20 min置換1次脫色液，直至徹底脫凈。

1.3.5.2 胰蛋白酶酶解

(1)膠粒脫色：將目的條帶切成1 mm3的膠粒，分別裝入1.5 mL離心管中。使用[V(ACN)∶V(50 mmol/L NH4HCO3)=1∶1]溶液脫色，放置10～30 min吸出棄去，重復此操作至膠粒無色。

(2)膠粒脫水：加入100 μL 100% ACN，放置30 min，待膠粒呈白色索狀至團狀，棄去ACN，室溫放置干燥。

(3)還原烷基化：各離心管加入100 μL 10 mmol/L DTT于56 ℃水浴中還原1 h，吸出棄去。然后各管加入100 μL 55 mmol/L IAA，暗處室溫反應1 h，吸出棄去。加脫色液[V(ACN)∶V(50 mmol/L NH4HCO3)=1∶1]洗1遍，吸出棄去，繼續加入100 μL 100% ACN，放置30 min，待膠粒呈白色索狀至團狀，棄去ACN，室溫放置干燥。

(4)酶切：各管加入7～10 μL 15 ng/μL的酶(用50 mmol/L NH4HCO3稀釋)，放入4 ℃冰箱孵育40 min，取出后各管補加5～10 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液，密封置于37 ℃水浴中酶切16 h。

(5)肽段提取：各管加入100 μL提取液[V(TFA)∶V(ACN)∶V(H2O)=1∶10∶9]，37 ℃水浴1 h后，超聲5 min，離心5 min，分離提取液后重復提取1次，合并提取液，真空離心干燥。

(6)脫鹽：酶切后的肽段經自填脫鹽柱脫鹽后，置于真空離心濃縮儀(45 ℃)中至溶劑揮發完全。

1.3.5.3 LC-MS/MS檢測

毛細管液相色譜條件：流動相A為0.1%甲酸(體積分數，下同)，流動相B為0.1%甲酸，80% ACN(體積分數)，流速600 nL/min，各組分的分析時間為66 min。

質譜條件：一級質譜設定：分辨率70 000m/z，AGCtarget：3e6，MaximumIT：100 ms，掃描范圍300～1 800m/z；二級質譜設定：分辨率17 500m/z，AGCtarget：1e5，MaximumIT：50 ms，TopN：20，掃描范圍200～2 000m/z。采用Maxquant(1.6.2.10)數據庫查找匹配目標蛋白。

1.4 數據分析

所有測試均重復進行3次，運用Origin 2018進行繪圖，SPSS 22對數據進行統計分析(P<0.05)，數據用均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 利口葡萄酒混濁物形貌分析

利口葡萄酒中混濁物通常是在貯藏過程中產生的，慢慢沉降到瓶底，形成棕色顆粒。一些混濁物顆粒附著在瓶壁上，形成不完整的薄膜。由圖1可見，利口葡萄酒混濁物外觀不規則，邊緣光滑(圖1-a)。當在更大的放大倍數下(圖1-b)混濁物具有層狀結構。小的層堆積成大的層，大的層堆積成更大的層。

a-×5 000；b-×10 000圖1 利口葡萄酒混濁物的SEM圖Fig.1 SEM image of haze in liqueur wine

2.2 利口葡萄酒混濁物XRD分析

如圖2所示，非晶原子在小衍射角區域有序，在大衍射角區域無序。在2θ值為19.5°時，發現典型的非晶態漫散衍射峰，說明混濁物中的配位原子密度很高，相應的非晶散射信號很強。在高衍射角區域(2θ>20°)沒有觀察到明顯的衍射信號。

圖2 利口葡萄酒混濁物的XRD圖Fig.2 XRD image of haze in liqueur wine

2.3 利口葡萄酒混濁物FT-IR分析

圖3 利口葡萄酒混濁物的FT-IR圖Fig.3 FT-IR spectrum of haze in liqueur wine

2.4 利口葡萄酒混濁成分分析

在利口葡萄酒貯藏過程中，蛋白質和多酚化合物結合并進一步聚集，形成共軛物，可能會導致沉淀[12]。如表1所示，利口葡萄酒混濁物中蛋白質含量相對最高，達(114.70±0.51) mg/g，顯著高于總酚和總糖的含量(P<0.05)，主要原因可能是試驗所用利口葡萄酒原料均由白葡萄品種組成，這與以往關于蛋白質是引起白葡萄酒混濁主要原因的研究結論相符[4]。

表1 利口葡萄酒混濁物主要成分含量Table 1 Content of main components of haze in liqueur wine

2.5 利口葡萄酒混濁物蛋白LC-MS/MS鑒定分析

2.5.1 混濁物肽段及蛋白分子質量分析

本試驗中，LC-MS/MS共鑒定到利口葡萄酒混濁物蛋白90個，肽段111條，其中唯一肽段數為1條的蛋白數量高達84種，極少數蛋白的唯一肽段數量達8條(圖4-a)。對蛋白分子質量數據進行分析發現，大多數蛋白分子質量分布在10～70 kDa(圖4-b)，且20～30 kDa蛋白數目高達21種，說明利口葡萄酒混濁物蛋白主要由低分子質量蛋白組成，該研究結果與張明霞[13]的報道相一致。

a-唯一肽段分布；b-蛋白分子質量分布圖4 利口葡萄酒混濁物蛋白唯一肽段及分子質量分布Fig.4 Unique peptides and molecular mass distribution of haze protein in liqueur wine

2.5.2 混濁物主要組成蛋白分析

由表2鑒定結果可知，利口葡萄酒混濁物中蛋白分子質量為9～142 kDa，主要為β-呋喃果糖苷酶(35.47%)、葉綠體內相關蛋白生長因子Tu(21.43%)、葡聚糖內切1, 3-β-D葡萄糖苷酶(7.72%)和病程相關蛋白(幾丁質酶、類甜蛋白、非特異性脂質轉移蛋白)，此外還含有酶類和線粒體內相關蛋白。其中幾丁質酶、類甜蛋白和脂質轉移蛋白被認為是果汁和葡萄酒中典型的病程相關蛋白，且與混濁形成有關[14]，可能是引起利口葡萄酒混濁的主要蛋白。

3 討論

本研究通過對利口葡萄酒混濁物形貌、結構和成分組成進行分析，初步探究了引起利口葡萄酒混濁的可能原因，試驗結果表明，混濁物中蛋白和總酚占據一定的比例，試驗中考慮到蛋白含量相對較高，進而采用LC-MS/MS對混濁物蛋白進行了鑒定分析，以便進一步討論造成利口葡萄酒混濁的主要蛋白。

蛋白鑒定發現利口葡萄酒混濁物中含有幾丁質酶、類甜蛋白和非特異性脂質轉移蛋白3類病程相關蛋白。研究表明，病程相關蛋白是引起葡萄酒混濁的主要蛋白，該類蛋白在釀酒過程中高度穩定，但其中一些會隨著時間的推移和溫度的升高而沉淀[15]。其中，類甜蛋白和幾丁質酶在葡萄發育的所有階段都有表達，它們的耐熱性使其容易受到變性和復性過程的影響，是促進分子聚集的基礎，且除了這2類致濁蛋白外，β-1, 3-葡聚糖酶、成熟相關蛋白grp22和脂質轉移蛋白也被認為與混濁形成有關[16-17]。FALCONER等[18]研究發現，幾丁質酶是‘長相思’和‘賽美蓉’葡萄酒混濁的主要原因，而類甜蛋白是僅次于幾丁質酶并可能會導致葡萄酒混濁的第二類蛋白，該報道與本研究結果相似。因此，幾丁質酶、類甜蛋白和非特異性脂質轉移蛋白可能是引起利口葡萄酒混濁的主要蛋白。

同時，當蛋白質發生解折疊和聚集時，蛋白質類型將影響最終聚集物的特性。本研究觀察發現利口葡萄酒混濁物由大小不一、不規則顆粒聚集形成，這可能是因為類甜蛋白和幾丁質酶形成的顆粒大小不同[5]，一些類甜蛋白亞型具有熱不穩定性且會發生可逆變性，優先與多糖、酚類化合物和亞硫酸鹽離子相互作用[19]，傾向于形成肉眼不可見的亞穩態的微團聚集體(在正常葡萄酒離子強度下<150 nm)，而幾丁質酶以其不可逆展開而聞名[20]，可以快速絮凝并產生清晰可見的大的聚集體(≥1 μm)[21]。

此外，本研究發現混濁物蛋白中含有一些酶類，如富含亮氨酸的重復受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BAM1和G型凝集素S受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該類酶是植物基因中已知的一類跨膜類受體激酶[22]，其能轉移出ATP中的磷酸，通過共價鍵與特定蛋白質中的某些絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基相結合，進而使蛋白質和酶的構象及活性發生改變。有學者報道，幾丁質酶含有較高的絲氨酸含量，類甜蛋白含有較高比例的蘇氨酸、賴氨酸和精氨酸殘留量[23]。然而，即使利口葡萄酒中存在該類蛋白激酶可能會有利于利口葡萄酒的蛋白穩定性，但在實際生產中，為獲得品質穩定的高質量利口葡萄酒，添加一定的澄清劑依舊十分必要。目前在商業釀酒中，蛋白質的穩定性幾乎是通過添加膨潤土來實現的，但蛋白質結合的膨潤土是以酒糟的形式松散地沉降到酒罐底部，約占原始葡萄酒體積的3%～10%[24]。從膨潤土酒糟中回收葡萄酒的方法費力且會造成葡萄酒體積損失，甚至可能會降低葡萄酒的質量[25]。因此，研究利口葡萄酒中混濁蛋白的種類及其特性，指導生產商在實際生產中使用針對性的蛋白酶或采取一定的生產技術對預防利口葡萄酒混濁具有一定的參考價值。

4 結論

利口葡萄酒混濁物顆粒大小不一、邊緣光滑，其含有蛋白和酚類等物質，且蛋白含量為(114.70±0.51) mg/g，顯著高于總酚和總糖含量(P<0.05)。幾丁質酶(27 kDa)、類甜蛋白(24 kDa)和非特異性脂質轉移蛋白(11 kDa)3類病程相關蛋白可能為引起利口葡萄酒混濁的主要蛋白。此外，蛋白如何與多酚和多糖等成分相互作用影響利口葡萄酒的品質有待進一步研究。